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麻花秦艽化学成分、生物活性及环烯醚萜含量测定的研究

发布时间:

北京化工大学 硕士学位论文 麻花秦艽化学成分、生物活性及环烯醚萜含量测定的研究 姓名:危士虎 申请学位级别:硕士 专业:化学工程与技术 指导教师:陈光 20100609

麻花秦艽化学成分、生物活性及环烯醚萜含量测定的研究

摘要

麻花秦艽为龙胆科龙胆属植物,其根具有祛风湿,清湿热,止 痹痛的功效;用于风湿痹痛,筋脉拘挛,骨节酸痛,日哺潮热,小 儿疳积发热。其化学成分较复杂,生物活性多样,未进行系统深入 的研究。 本文利用液一液萃取、硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、ODS柱色谱、
Sepdehax.LH

20柱色谱等分离手段,从麻花秦艽的根中分离得到23

个化合物,通过理化性质和波谱方法鉴定了22个化合物,分别为: 7(S)-n—butyl morroniside(1)、7(R)一n-butyl morroniside(2)、6’一0一acetyl
gentiopicroside

(3)



6’-O-(2一hydroxy-3一O≯-D_glucopyranosyl

-benzoyl)一sweroside(4)、gentiopicroside(5)、swertiamarin(6)、 sweroside(7)、logannic acid(8)、6’一O-伊D—glucosylgentiopicroside(9)、 2'-0-(2,3-dihydroxyl—benzoyl)-sweroside(10)、macrophyiioside D(11)、 (-)-syringaresinol-4,4'-bis-fl-O-D-glucopyranoside (12)


gentiaphyllide—D(13)、gentiaphyllide-E(1 4)、erythrecentaurin(1 5)、
roburic

acid(16)、uvaol(17)、daucosterol(18)、fl-sitosterol(19)、

gentianose(20)、fl-glucose(21)矛n a—glucose(22);其中化合物l、3 和4是新化合物;化合物2为首次由龙胆属植物分离得到的化合物; 化合物6、7、8、9、11、12、13、14、1 5、1 6和20为首次由麻花

北京化工大学硕.I:学位论文

秦艽中分离得到的化合物。 在生物活性方面,本文对由麻花秦艽中分离得到的5种裂环环 烯醚萜(4,5,6,7,9)进行了与抗炎和抗氧化作用相关的生物活性的 研究,并初步探讨了它们的构效关系。实验表明,5个环烯醚萜化合 物均对N.甲酰蛋氨亮氨酰苯丙氨酸(fMLP)诱导的人中性粒细胞自 由基的产生显示浓度依赖性抑制作用,其中化合物9的作用最强。 化合物4和5对花生四烯酸(AA)和佛波醇.12.十四烷酸酯.13.乙酸 酯(PMA)诱导的人中性粒细胞自由基的产生显示浓度依赖性抑制 作用,其中4的抑制作用强于5;化合物6、7和9不显示明显的抑 制作用。5个环烯醚萜化合物均对红细胞的脂质过氧化无明显的保护 作用。测试了5个环烯醚萜化合物的溶血作用,发现在明显高于显 示抑制活性的浓度下不发生溶血作用。动物实验方面,研究了化合 物4和5对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响,两种化合物对二甲苯所 致小鼠耳肿胀均有抑制作用,化合物4的抑制活性强于化合物5。 本文还建立了HPLC.UV/MS法对秦艽中环烯醚萜化合物(1.10) 的含量进行了测定。色谱柱为Kromasil.C18柱;流动相为体积分数 为0.04%磷酸的水(A)和甲醇(B),O.10 min内10.20%的B线性 梯度洗脱,10一20 min内20%的B等梯度洗脱,20.65 min内20.75 的B线性梯度洗脱;流速为l mL/min;柱温为25℃;检测波长为
254

nlll;质谱检测时流动相以甲酸替换磷酸。该方法具有良好的线

性关系和回收率,可以为秦艽的质量控制和开发提供科学依据。

摘要

关键词:麻花秦艽,化学成分,环烯醚萜,中性粒细胞,自由基, 脂质过氧化,溶血作用,HPLC.UV/MS,含量测定

III

ABSTRACT

STUDIES ON CONSTITUENTS,BIOLOGICAL ACTIVITIES AND

QUANTITATIVE ANALYSIS OF

IRIDoIDS IN THE RooTS oF

GEⅣ刀阴^■S删几Hn陧渊

MAXIM.

ABSTRACT

The

roots

of Gentiana straminea

Maxim.(Gentianaceae)has

the

effect of rheumatism,clearing heat and easing bitongkang,which has been used
for the treatment of rheumatic

arthritis,icteric hepatitis,

constipation,pain and hypertension.Little is known about constituents

and biological activities of Gentiana straminea Maxim. 23 compounds were isolated from the
roots of Gentiana straminea

Maxim

on

column chromatography of silica gel,Sephadex LH-20,ODS
on

and polyamide.Among them,22 compounds were identified
of chemical

the basis

and spectral methods morroniside

as:7(S)一n—butyl morroniside(1),
6'-O-acetyl gentiopicroside

7(R)一n-butyl

(2),

(3), (4),

6'-0-(2-hydroxy一3一O?伊D_glucopyranosyl—benzoyl)一sweroside

gentiopicroside(5);swertiamarin(6),sweroside(7),logannic acid(8), 6’一D-伊D-glucosylgentiopicroside (9), 2’-O一(2,3一dihydroxyl—benzoyl)

一sweroside(10),macrophyiioside D(1 1),(一)-syringaresinol-4,4'-bis一 伊D—D-glucopyranoside(12),gentiaphyllide—D(13),gentiaphyllide—E


北京化工人学顾.ij学位论文

(14),erythrecentaurin(15),roburic acid(16),uvaol(17),daucosterol(18), fl-sitosterol 19),gentianose(20),∥-glucose(2 1)and仅一glucose(22).
Among these compounds,1,3 and 4 were new compounds;2 was

isolated from this genus

for the first time;6—9,1 1—1 6 and 20 were

isolated from this plant for the first time. Antioxidation bioactivity of five from the roots of Gentiana straminea

secoiridoids(4,5,6,7,9)isolated Maxim
were tested.On the basis of was

experiment data,the link of
found that

structure and activity

discussed.We
generation in

these compounds suppressed the superoxide neutrophils induced by

human

N??formyl?-methionyl?—leucyl

-phenylalanine(fMLP)in



concentration—dependent manner,especially

compound 9 showed the strongest effect.Compound 4 and 5 suppressed the superoxide generation in human neutrophils induced by Arachidonic

acid(AA)and

Phorbol一1 2一myristate一1 3一acetate(PMA)and compound 4
on

showed the stronger effect.The effect of the five secoiridoids

lipid

peroxidation of erythrocyte membrane ghosts by hydroxyl radicals was also studied and we found these compounds exhibited almost
no

effect

on

lipid peroxidation level.It was found that the five secoiridoids showed

no

hemolytic effect
than

even

at

high concentrations,which was much higher
sufficient

the concentrations

for the suppression of superoxide
on

generation.We

also studied the effect of compound 4 and 5

auricula

edema in mice by induced dimethylbenzene.Two compounds showed

VI

ABSTRACT

inhibit activity and compound 4 exhibited stronger effect.
In

this study,a new HPLV—UV/MS method was developed for
ten

simultaneous determination of

iridoid and secoiridoids in the
on a

roots of

G.straminea.Separations were performed

Kromasil—C 1 8 column by acid.The

gradient elution using methanol and water with phosphoric

velocity,column

temperature and detect wavelength were 1.0 mL/min,

25。C and 254 nm,respectively.Analytes were also identified by HPLC coupled with electrospray ionization mass spectrometry experiments.The quantitative method was validated for linearity,precision,accuracy,and limits of detection and quantification.

KEY

WORDS:

Gentiana

straminea

Maxim.,constituents,iridoids,
peroxidation,

human

neutrophils,

superoxide,lipid

Hemolysis,HPLC—UV/MS,quantitative analysis

VII

北京化工大学位论文原创性声明

本人郑重声明:

所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立

进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。

作者签名:



日期:

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学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文的 规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属北京 化工大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件 和磁盘,允许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部 或部分内容,可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。

保密论文注释:本学位论文属于保密范围,在上年解密后适用本授
权书。非保密论文注释:本学位论文不属于保密范围,适用本授权书。

作者签名:筵逸
导师签名:笪二蹦

日期:盈坦:堑:乞

第一章绪论

第一章绪论
1.1绪言
秦艽为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)秦艽组(Sect.Cruciata
Gaudin)植物大叶秦艽(Gentiana
straminea dahurica macrophylla

Pall.)、麻花秦艽(Gentiana Duthie.)和小秦艽(Gentiana

Maxim.)、粗茎秦艽(Gentiana

crassicaulis

Fisch.)的干燥根,具有祛风湿,清湿热,止痹痛的功效。用于风湿痹痛,

筋脉拘挛,骨节酸痛,R晡潮热,小儿疳积发热I¨。秦艽作为我国传统重要的中 药,始载于《神农本草经》,列为中品,“秦艽主寒热邪气,寒湿风痹,肢节痛, 下水,利小便”。《名医别录》称“秦艽能疗风,无问久新,通身挛急"【2】。由此

可见,秦艽在祖国医学中是治疗风湿麻痹,关节病必不可少的药物。 目前,各国学者对大叶秦艽研究较多,发现其化学成分主要为环烯醚萜类 化合物,其中含量最高的为龙胆苦苷,已应用于临床,用于风湿性疾病的治疗。 做为秦艽组中用药的一种,麻花秦艽还没有进行系统深入的研究,仅对其化学成
分和药理活性进行了初步的的研究。 麻花秦艽(G
straminea

Maxim.)为龙胆科龙胆属多年生草本植物,别名大

叶秦艽(西藏)、麻花艽,藏医称“解吉嘎保99 9是我国重要的常用中藏药材资源
之一,已有2 000年的药用历史。以根和花入药,具有清热利胆、舒筋止痛之功

效,用于治疗风湿性关节炎、肺结核、低热盗汗、黄疸型肝炎、二便不通、麻风、 毒热、各种出血,外敷消肿。现代研究亦表明,藏药麻花秦艽具有多种药理作用 和临床应用价值【3】。目前由于人为的大范围采集,其野生资源越来越匮乏,急需
对其进行深入系统的研究,除阐明其药效机制外,还可以为其人工栽培提供质量

监控依据,促进其大范围的人工养植,保护西部野生资源和自然环境。因此着手 对麻花秦艽进行化学成分、抗炎机制和质量控*醒芯俊

1.2植物形态[3】
麻花秦艽(G
straminea

Maxim.)为多年生草本,高10-~35 ClTI,全株光滑,

基部被枯存的纤维状叶鞘包裹。须根多数,扭结成1个圆锥形根。花枝多数,斜

升,黄绿色,稀带紫红色,*圆形。莲座丛叶宽披针形或卵状椭圆形,两端渐狭,

叶脉3—5条,在两面均明显,并在下面突起,叶柄宽,膜质;茎生叶小,线状
披针形至线形。聚伞花序顶生及腋生,排列成疏松的花序;花梗斜伸,不等长;
花萼膜质,一侧丌裂,萼齿2 5,钻形;花冠黄绿色,喉部具绿色斑点,漏斗形,

裂片卵形,褶偏斜,三角形;雄蕊整齐。蒴果内藏,种子褐色,表面有细网纹。
花果期7~10月。

北京化工大学硕士学位论立

该植物主要分布于我国的西藏、四川西部、湖北西部、青海、甘肃、宁夏: 生于山坡草地河滩、灌丛、林缘、高山草甸,分布在海拔2
000~5

000米。

麻托鬻艽

麻花秦艽干燥根

第二章秦艽的研究概况

第二章秦艽的研究概况
2.1秦艽的化学成分研究现状
秦艽化学成分从总体上讲十分复杂,但是从前人工作的成果来看,并不是 很深入,尤其是国内的研究并没有可以称得上系统的工作。早期的研究者认为秦 艽主要含有生物碱成分,1958年傅丰永等【4】首先从中分离出了三种生物碱,分别

命名为秦艽碱甲、秦艽碱乙和秦艽碱丙。但是后来的研究者指出秦艽中不存在生 物碱,而是存在大量的以龙胆苦苷为主的环烯醚萜苷类化合物,生物碱的存在是
由于提取过程中加入氨水的缘故。郭亚健等【5】的实验也验证了这一观点:以后的 研究工作还表明氨水浓度和提取溶剂以及转化条件的不同,所得生物碱的结果不

刚61。秦艽中生物碱和苦苷类是共存还是相互转化还需要进一步研究。
随着现代分离技术和分析技术的发展,*几年来各国学者对秦艽的化学成 分进行了一系列的研究,发现秦艽中主要含有环烯醚萜类、三萜类和甾醇类等成 分。综合文献【7’14】,秦艽中已分离得到化合物见表2.1。
表2-1秦艽已知化学成分
Kind ofthe compounds Iridoids gentiopicroside sweroside swertiamarin 7 9 13 9 9 9 9 9 9 12 7 12 8 8 8 8 13 l3 l3 13 l3 l3 14 14 8 8 8 8 8 Compound Reference

6’-O—p-D—glucosylgentiopicroside 6'-O-13??D?-glucosylsweroside
triofloroside Ridoside macrophylloside A macrophylloside B

qinjioside



2。-(o,m-phenyglycin)sweroside
harpaposide gentiaphyllide A gentiaphyllide B gentiaphyllide C boonein loganic acid loganic acid memVl ester secologanic acid loganic acid ll-O—B—D—glucopyranosyl ester gentistraminosides A gentistraminosides B

Alkaloids

gentianine gentianal gentianadine gentianamine gentianaine

(.).dioseorine
2-methyl.5.oxoisoauinuclidin



北京化工人学硕jj学位论文

Chromenes

anofinic acid 2.methoxyanofinic acid 6.acetyl.7.methoxy-2,2-dimethylchromen macrophylloside C macrophylloside D oleanolic acid ursolic acid a-amyrin

9 9 8 8 13 10 7 11 7 ll 7 13 13 11 8 11 8 8 8 8 9 9 9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 9 8 7 10 1l 1 l 10 7 8 8 8

Triterpenoids

13-amyrin
roburic acid uvaol 1

0【,2a,3p,24一tetrahydroxyolean一1 2一eIl-28-oic acid 3/3,6a,24一trihydroxyolean-1 2-ell一28一oic acid
6.sitosterol 6.sitosterone
daucosterol

Sterols

B.sitoster01.3.O.gentiobioside
stigmasterol Flavonoids apigenin kaempfcrol kurarinone kushenol I isovitexin Benzenoids protocatechualdehyde protocatechuic acid 2,3-dihydroxybenzonic acid vanillic acid P—hydroxybenzaldehyde 4.hydFOXybenzoic acid p-coumaric acid ethyl P.hydroxycinnamate

methyl P—cis-hydroxycinnamate
Furans 5-hydroxymethyl..2..furaldehyde 5-methyoxyfuran..2..carbaldehyde 5.methyoxymethylfuran.2.carboxaidehyde 5.formylfumn-2-carboxylic acid Lignans

.Othel-¥

(+)-episyringaresinol (-)-syringaresinol-4,4’-bis-O—B—D-glucopyranoside methyl-2-hydroxy-3一(1一O一13-D-glucopyranosyl)OXybenzoate
gentiaphyllide E

ethyl-p-D-glucopyranoside
erythrocentourin erythrocentourin acid montanic acid

montanic acid methyl

ester

N—pentacosy一2一carboxy_benzoylamide gentiaphyllide D glyceryl.1.butcosanate butyl.0【.D.sorbopyranoside



第二章秦艽的研究概况

2.2秦艽的药理作用
2.2.1抗炎作用

研究表明,秦艽粗制剂及其化学成分有不同程度的抗炎活性。秦艽中性乙醇
制剂对大鼠蛋白性关节炎能减轻关节肿胀程度并加速其消褪【l*;龙胆苦苷对二甲

苯所致小鼠耳肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀、蛋清致大鼠足肿胀、酵母多糖所致
大鼠足肿胀、棉球诱导的大鼠肉芽组织增生具有一定的抗炎作用【l61,但对制霉菌 素所致小鼠足肿胀无明显的抑制作用【l 6,1。刀;腹腔注射秦艽碱甲能减轻甲醛性及蛋

清性关节肿胀,加速肿胀消褪【博1;落干酸也有一定程度的抗炎作用。

2.2.2保肝利胆作用

龙胆苦苷对四氯化碳所致急性肝损伤有显著的保护作用,其保肝机制与对抗 自由基脂质过氧化密切有关;龙胆苦苷能够增加胆汁流量,增加胆汁中总胆红素、 游离胆红素的浓度,促进胆红素的排泄,起到治疗湿热黄疸的作用【191。由于龙胆 苦苷的显著保肝作用,已被开发为中药一类新药秦龙苦素。

2.2.3抗菌作用

秦艽粗制剂对炭疽杆菌、霍乱弧菌、异形痢疾杆菌、产气杆菌、流产杆菌、
金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、副伤寒杆菌A、肺炎杆菌、伤寒杆菌等均有抑

制作用‘20】;从大叶秦艽中分离得到的anofinic

acid、2-methoxyanofinic acid、

kurarinone及kushenol I对C.cucumerinum和C.albicans有不同的抑制作用‘9】;秦

艽的水浸液在试管内对多种不同的皮肤真菌有不同程度的抑制作用。

2.2.4中枢神经作用

龙胆苦苷能够明显减轻小鼠由于腹腔注射冰醋酸引起的急性腹膜炎而产生

持久的疼痛刺激,可以提高痛阈值,对热刺激引起的疼痛有一定的缓解作用‘161; 秦艽碱甲小剂量时对大鼠小脑有镇静作用,增强戊巴比妥钠的催眠作用,大剂量 时则有中枢兴奋作用,出现兴奋、惊厥、导致麻痹死亡【211。



北京化T人学硕士学位论文

2.2.5其它作用【22之6】

秦艽与其他中药配伍时可以治疗阴虚型咳嗽、败血病、面瘫、脑出血后遗症 等;秦艽根乙醇超声提取,石油醚萃取物对小菜蛾有杀虫活性;龙胆苦苷能够抑 杀疟原虫;龙胆苦苷能够促进胃液和游离盐酸分泌,起到健胃的作用;獐芽菜苦 苷对无水乙醇所致小鼠胃溃疡有保护作用;秦艽生物碱甲能够抑制心脏引起的血 压下降,心率减慢;秦艽生物碱甲还对兔的蛋清过敏性休克有显著地保护作用, 升高实验动物的血糖浓度。 由以上综述可以看出,秦艽的化学成分复杂,药理活性多样,多为*年来才 开始研究,麻花秦艽、粗茎秦艽和小秦艽的研究更不系统;因此我们深入研究麻 花秦艽的化学成分及其生物活性,为进一步的新药研究和开发奠定基础。



第三章麻花秦艽的化学成分研究

第三章麻花秦艽的化学成分研究
利用液一液萃取、硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、ODS柱色谱、Scpdehax-LH
20

柱色谱等分离手段,从麻花秦艽的根中分离得到23个化合物,通过理化性质和 波谱方法鉴定了22个化合物;其中有3个新化合物,1个化合物首次从龙胆属
植物中分离得到,11个化合物为首次有麻花秦艽中分离得到。

3.1化合物的提取与分离
干燥的麻花秦艽的根(10 kg)切片后,以90%的乙醇回流提取3次,每次2 小时,合并提取液,浓缩后得到的浸膏依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正 丁醇部分通过反复硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Scpdehax.LH 20柱色谱等手段分

离,理化性质和波谱方法鉴定得到22个化合物;各个化合物的编号、名称、结
构和类型见表3.1。 表3.1麻花秦艽化学成分的编号、名称、结构和类型
Table 3-1 The number,name,structure and classification of constituents from the roots of Gentiana straminea NO



一幸◆ITIOH
Name

Structure

Classification

0n0

0‘一砌oid



oi瑚oid

H辞妙邑


gen鲁:;:::;墨事奎?

H岛~laOCOCHa碍0


sec。1打d。1d

北京化T人学硕一I:学位论文



6'-0-(2一hyaroxy-3-o-p—D— glucopyranosyl-benzoyl)
.sweroside***

secoiridoid

H岛



gentiopicroside

secoiridoid

H岛



Swertiamarin*

secoiridoid





Sweroside*

secoiridoid







logannic acid掌

iridoid



H 9

G—o-8-D-glucosyl-
一gentiopicroside木

secoiridoid



第三章麻仡秦艽的化学成分研究

10

2'-0-(2,3一dihydroxyl- -benzoyl)-sweroside
secoiridoid

H岛



11

macrophylloside D木

科09k‰一


(-)-syringaresinol-4,4’-bis一 9-o—D—glucopyranoside毒

Li印锄

gentiaphyllide-D?

other

gentiaphyllide—E事 H

Benzoic acid derivatives

OCHa

erythrecentaurin毒

0ther

16

roburic acid*

triterpene



北京化T人学硕士学位论文

17

uVaol

18

19

a。◆sta.ol daug。∞一


H。茹秽H20H劬一e

20

心toH。一H—K~ 刚汹嘲奎Hw拳‰…
H9H
芦龟,uc。se

2l

H早(舌冬i;捧。H

sac c:h剐ride

22

仅喀?uc。se

H早e耋l淑。H

sacch卸ride

唪幸宰新化合物 宰}龙胆属首次分离得到的化合物 事麻花秦艽中首次分离得剑的化合物

10

第三章麻花秦艽的化学成分研究

3.2化合物的鉴定
3.2.1新化合物的鉴定 化合物1
H3

白色粉末状结晶,mp.179.180。C,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish

反应呈阳性。【+]ESI.MS给出准分子离子峰485.6[M+Na]+,结合DEPT谱推出
分子式为C21H340ll。 1H.NMR谱中中,在高场处的信号60.86(3H,t,J=1.8Hz)和61.26(3H,d, J=6Hz)为两个甲基的信号;较高场处的信号63.64(3H,s)为甲氧基的信号;低场 氢信号67.41(1H,d,J=1.8Hz)、85.50(1H,d,J=3.6Hz)与13C.NMR谱中的893.8 碳信号提示该化合物为环烯醚萜类化合物。 13C-NMR谱中,低场处的6168.8为羰基碳信号;8152.5和8109.0为烯碳信 号且8152.5为连氧烯碳的信号;较高场处的851.5为甲氧基的碳信号;高场处的

814.2为甲氧基的碳信号。877.7.861.5范围内的5个碳信号为糖上的信号,由其 化学位移特征推测化合物连有一个葡萄糖,进一步对其进行酸水解,检出葡萄糖。 13C-NMR谱结合DEPT谱可以推测在较高场处898.1应为连有两个氧的叔 碳信号;在HSQC谱中,898.1与64.32(1H,dd,J=9.6Hz,1.8Hz)存在直接相关。
HMBC谱中,甲氧基氢信号63.64与羰基碳信号8168.8存在远程相关,说明甲

氧基连在羰基上。基于以上数据分析,该化合物应为一个morroniside型的环烯 醚萜苷类化合物。该分子中除含一个morroniside母核单元,还含有一个葡萄糖; 去除morroniside母核单元和葡萄糖的17碳外,”C-NMR谱上还有四个碳信号; 结合DEPT、HSQC和HMBC谱,推测分子中含有一个一OCH2CH2CH2CH3基团, 其碳化学位移分别为867.7、831.9、819.3和814.2,氢化学位移分别为63.52
(IH,m)、83.44(IH,m)、81.46(2H,m)、81.30(2H,m)和60.86(3H,t,J=1.8Hz)。

在HSQC谱中,甲基氢信号61.26与碳信号820.4存在直接相关;64.46(1H,d, J=8.4Hz)的氢信号与898.9处的碳信号存在直接相关,为葡萄糖的端基信号,氢

北京化1=人学硕l:学位论文

信号的偶合常数J=8.4Hz说明端基构型为口型;而在HMBC谱中,葡萄糖端基
氢信号64.46与893.8处的碳信号存在远程相关,说明葡萄糖在1位成苷;氢信 号63.52、63.44与碳信号898.1有远程相关,氢信号64.32与碳信号867.7有远程

相关,说明.OCH2CH2CH2CH3连在7位上。进一步通过HSQC和HMBC的相
关信号可以将化合物的氢碳信号完全归属,见表3.2。 在NOESY谱中,7位上氢信号64.46与8一CH3的有相关关系,说明此化合

物7位上氢为伊H,构型为S型。
经过以上分析,化合物的结构应为7(s)一n—butyl morroniside。经系统查阅文 献,未见报道,是一个新化合物。其主要HMQC和NOESY关系见图3.1。
表3-2化合物1和2的核磁数据OaMSO.d6)
No 6H l 3 4 5 6 7 l 6c 93.8 152.5 109.0 24.6 31.8 98.1 6H 2 6c 94.OO 150.6 110.5 24.1 31.0 96.8 62.5 42.1 20.2 166.9 51.7

5.50(1H,d,J=3.6 Hz)

5.43(1H,d,J=3.6 Hz)

7.41(1H,d,J=1.8 Hz)


7.32(1H,brs)


3.40(1H,m) 3.05(1H,m) 2.34(1H,m)

2.79(1H,m) 3.05(1H,m) 2.04(1H,m)

4.32(1H,dd,J--9.6

Hz,

4.70(IH,dd,J=4.2

Hz,

8 9 10 ll -OCH3 Glc l’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

1.8Hz)4.8Hz) 67.7 3.68(1H。m) 3.74(1H,m) 1.70(1H,m)41.7 1.74(1H,m)

1.26(3H,d,J=6 Hz)


20.4 166.8 51.5

1.20(3H,d,J=6 Hz)


3.64(3H,s) 4.46(IH,d,J--8.4Hz)
2.96(1H,m) 3.14(1H,m) 3.03(1H,m) 3.05(1H,m) 3.68(1H,m)

3.61(3H,s) 4.49(1H,d,J=8.4Hz)
2.96(1H,m) 3.14(1H,m) 3.03(1H,m) 3.05(1H,m) 3.68(1H,m)

98.9 73.5 77.7 70.5 77.1 61.5

98.9 73.6 77.7 70.6 77.1 61。6

3.44(IH,m)
刀一Butyl 1”

3.44(1H,m)
67.7 31.9 19.3 14.2

3.52(1H,m) 3.17(1H,m) 1.46(2H,m) l-30(2H,m) 0.86(3H,t,J=1.8 Hz)

3.53(IH,m)
3.25(1H,m) 1.43(2H,m) 1.3l(2H,m) 0.86(3H,t,J=1.8 Hz)

66.5

2” 3,, 4¨

31.7 19.3 14.1

12

第三章麻花秦艽的化学成分研究

H3

H3

图3-1化合物1的HMBC和NOESY相关关系图
Fig.3-1 key

HMBC

and NOESY correlations of compound 1

化合物3



白色针状结晶(甲醇),mp.208.209。C,比旋光度[伐]D24—29.7。(c=O.25,
MeOH),10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性。(+)ESI.MS给 出准分子离子峰421.1[M+Na]+,结合1H.NMR,13C.NMR推出分子式为
CIsH22010。

1H.NMR谱中,67.40(1H,s)为一连氧烯氢信号;65.68(1H,m),85.64(1H,

m),65.18(2H,m)三组信号为烯氢信号。64.54(1H,d,J=7.8Hz)为一糖端基信号;

北京化-T大学硕J?学位论文

62.01(3H,s)为一甲基信号,其化学位移偏向低场,说明甲基与一吸电子基团相 连。 13C.NMR谱中,8170.7和8163.2为两组羰基碳信号,8149.2.8103.9之间的 六个碳信号应为烯碳。结合HSQC谱,899.6为糖端基信号;876.8.863.8之间的

五个碳信号为糖的碳,由其化学位移特征推测为葡萄糖,进一步对化合物进行酸 水解,检出葡萄糖,由此可以确定分子内连有一个葡萄糖;氢信号的偶合常数 J=8.4Hz说明端基构型为∥型。821.2应为甲基碳信号,进一步验证了甲基应与一
吸电子基团相连。

在HMQC谱中,67.40(1H,s)、85.43(1H,d,J=2.4Hz)的氢信号分别与8149.2、 897.4碳信号有直接相关,揭示化合物应为环烯醚萜类化合物。65.68(1H,m)、 65.64(1H,m)、85.18(2H,m)三组氢信号分别与6134.5、6116.8、8118.4的碳信 号有直接相关,说明化合物应为龙胆苦苷类型的化合物。将其数据与龙胆苦苷的 数据相比较,除多一羰基信号和一甲基信号外,其余信号数据都较接*,由此推
断出化合物为龙胆苦苷的衍生物。结合HMBC谱,8163.2的碳信号与62.01(3H,

s)、84.26(1H,d,J=12.0Hz)和64.08(1H,dd,J=12.0,6.6Hz)的氢信号有远程相关, 说明分子中有一个乙酰基团,且乙酰基连在葡萄糖的6位上。进一步通过HMQC
和HMBC谱的相关信号,可以将该结构片段的氢碳信号完全归属,见Table3.3。

综上所述,化合物的结构为6'-0.aeetyl gentiopicroside。经系统查阅,未见报到, 是一个新化合物。化合物3的主要HMQC关系见图3.2。
表3.3化合物3的核磁数据(DMSO—d6)
No 5H l 3 4 5 6 7 8 9 lO ll Glc l’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 3 8c 97.4 149.2 103.8 125.3 116.8 69.7 134.5 118.4 163.2 99.6 73.2 74.4 70.2 76.8 63.8

5.43(1H,d,J=2.4 Hz)

7.40(1H,s)
. .

5.64(1H,m)
5.04(2H,m)
5.68

f1H,in)

3.3l(1H,m)44.9

5.18(2H,m)


4.54(1H,d,J=7.2 Hz) 2.96(1H,m)
3.4l(1H,m) 3.11(1H,m)

gH3CO—
CH3CO-

3.17(1H,m) 4.08(1H,dd,J=12.0,6.6 Hz) 4.27(1H,br d,J=12.0 Hz) 2.02(3H,s)


21.2 170.7

14

第三章麻花秦艽的化学成分研究

图3_2化合物3的HMBC相关关系图
Fig.3-2 key

HMBC

correlations of compound 3

化合物4

H岛



白色粉末状结晶,mp.179—180"C,比旋光度[(I]D24-34.5。(c=0.25,pyndine),
lO%HES04乙醇显色呈紫红色斑点,FeCl3反应呈阳性,Molish反应呈阳性。(+)

ESI.MS给出准分子离子峰679.7【M+Na]+,同时(。)ESI.MS给出准分子离子峰
655.6【M.HI+1,结合13C-NMR谱推出分子式为C29H36017。 1H-NMR谱中,低场氢信号81 0.03(1H,br)为活泼氢信号;67.38(1H,d,

J=7.8Hz)、87.36(1H,d,J=7.8Hz)和66.83(1H,t,J=7.8Hz)三组氢信号具有较明 显的三取代苯环特征,根据偶合常数推测苯环应为ABC系统:67.46(1H,br
的信号为环烯醚萜的特征信号。 13C.NMR谱中,6168.3和8165.1处的信号为羰基碳信号;8150.9.8105.2范
s)

围内的信号除去苯坏上的6个碳信号外还剩4个信号,从化学位移来看,为烯碳 信号,说明分子中含有两个双键,1H.NMR谱中65.21(1H,d,J=16.2Hz)和65.18 (1H,d,J=9.6Hz)处的信号也印证了分子中含有双键。以上信息说明环烯醚萜类
型应为sweroside型。fi77.6.864.6范围内的信号除去环烯醚萜环上的信号外,剩

余的10个信号为两个糖除去端基碳的信号,从其化学位移来看分子中应含有两
15

北京化1=人学硕I:学位论文

个葡萄糖,进一步对其进行酸水解,检出葡萄糖。 通过以上分析,可以推测出该分子应是sweroside衍生物,除母核外,应还

含有一个三取代苯环,一个羰基和一分子葡萄糖。比较此化合物与化合物 gentiotrifloroside[27】的1H-NMR和13C-NMR数据发现很相似;但由于两个化合物 的溶解性不同(gentiotrifloroside溶于MeOH),说明化合物4的部分位置的连接顺
序与化合物gentiotrifloroside不一样。 HSQC谱中,65.28(1H,br s)处的氢信号与897.0处的碳信号有直接相关; 氢信号64.83(1H,d,J=6.8Hz)和64.61(1H,d,J=7.8Hz)分别与6101.6和899.2处

的碳信号有直接相关,这两处的信号为葡萄糖的端基信号,从偶合常数来看,两 个葡萄糖的构型都为∥型。在HMBC谱中,葡萄糖端基氢信号64.6l与897.0处 的碳信号存在远程相关,55.28的氢信号和899.2处的碳信号存在远程相关,这 些说明葡萄糖在1位成苷;8168.3处的碳信号与弘.38(1H,m)、84.58(1H,br
d,

J=9.6Hz)和67.38(1H,d,J=7.8Hz)等三处氢信号存在远程相关,说明羰基连在 糖的6’位和苯环上:另一个葡萄糖端基氢信号64.83与苯环上8146.5处的碳信号 存在远程相关,说明这个葡萄糖端基通过氧键与苯环成苷。进一步通过HMQC 和HMBC谱的相关信号,可以将该结构片段的氢碳信号完全归属,见Table3.4。 综上所述,化合物4的结构6'-O-(2一hydroxy-3一D伊D-glucopyranosyl—benzoyl) .sweroside。经系统查阅,未见报到,是一个新化合物。化合物4的主要HMQC
关系见图3.3。
表3-4化合物4的核磁数据(DMS0Ⅷ6)
NO 6H l 3 4 5 6 4

5c
97.00 15I.9 105.2 27.2 24.6

5.28(1H,br s)
7.46(IH,br s)


2.98(1H,m) 1.48(IH,m) 1.71(1H,m) 4.25(1H,m) 4.23(1H,m) 5.42(1H,m)

7 8 9 10 ll Glc l’ 2’ 3’ 4’ 5


68.2 132.6 120.7

2.64(1H,m)42.0

5.18(IH,d,J=9.6Hz) 5.21(1H,d,J=16.2Hz)


165.1

4.61(1H,d,J=7.8Hz)
3.05(1H,m) 3.59(1H,m) 3.25(1H,m) 3.32(1H。m) 4.38(1H,m) 4.58(1H,brd,J=9.6Hz)

99.2 73.4 74.2 70.4 76.5 64.6

6’

16

第三章麻花秦艽的化学成分研究

l” 2” 3” 4” 5” 6”
7,,



168.3 115.O 123.2 119.2 121.4 146.5 150.5



7.38(1 H,d,J=7.8Hz) 6.83(1H,t,J=7.8Hz)

7.36(1H,d,J=7.8Hz)
. 一

Glc l”’ 2”’ 3”7 4"’ 5¨’ 6"’

4.83(1H,d,J=6.8Hz)
3.31(IH,m) 3.32(1H,m) 3.17(1H,m) 3.34(1H,m) 3.59(1H,m)

101.6 73.7 76.8 70.2 77.5 61.2

3.69(1H,d,J=9.6Hz)

H岛

图3-3化合物4的HMBC相关关系图
Fig.3-3 key

HMBC

correlations of compound 4

3.2.2已知化合物的鉴定

化合物2
CH3

白色粉末状结晶,mp.179—180"C,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish 反应呈阳性;分子式为C2lH340ll。
17

北京化丁人学硕Jj学位论文

以柱色谱分离时,化合物2与化合物l混在一起共结晶,混合物的核磁数据

成对出现,这说明化合物1与化合物2是一对异构体【2引。以制备液相分离此混合
物,得化合物1与化合物2的单体化合物。 化合物2的鉴定过程与化合物l的相似,其核磁数据与化合物1的数据比较 接*;只是在NOESY谱中,丁基2”位上氢信号61.43与8.CH3的有相关关系, 说明此化合物7位上氢为a.H,构型为R型。 通过分析,化合物的结构应为7(R).n.butyl morroniside。通过查阅文献,化 合物2为首次从龙胆属植物分离得到的化合物;也是首次得到其详细的核磁数

据。。化合物2从龙胆科Hydrangea属植物中分离得到过【291,但未有文献报道
过此化合物的核磁数据。其核磁数据见表3.2;主要HMQC和NOESY关系见图
3.4。


/—、


图3-4化合物2的HMBC和NOESY相关关系图 F追.3-4 key HMBC
and NOESY correlations of compound 2

第三章麻花秦艽的化学成分研究

化合物5

H岛
白色粉末状结晶,mp.110.113℃,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish

反应呈阳性,‘酸水解检出葡萄糖。 1H.NMR谱中,低场氢信号67.46(1H,s)以及较低场信号65.68(1H,d, J=3.0Hz)为环烯醚萜类化合物的特征信号;85.79(1H,m),85.63(1H,m)和65.25 (2H,m)为双键氢上的信号;64.66(1H,d,J=8.4Hz)为葡萄糖糖的端基信号,根 据偶合常数可以推测葡萄糖的构型为口型。将其1H.NMR谱数据与文献【30】报道 的龙胆苦苷数据对照基本一致;且其与龙胆苦苷对照品共薄层Rf值及斑点颜色
均一致;故鉴定该化合物为龙胆苦胆。

化合物5的1H.NMR谱的数据如下:5.68(1H,d,J=3.0Hz,H.1),7.46(1H,s,
H-3),5.63(1H,m,H-6),5.08(1H,m,H一7),5.03(1H,m,H一7),5.79(1H,m,H一9), 5.25(2H,m,H-10),4.66(1H,d,J=8.4Hz,H-1,),3.92-3.15(6H,H-2’,3’,4’,5’,6’)。 化合物6

H岛

白色粉木状结晶,mp.111.113。C,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish 反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。与标准品獐芽菜苦苷共薄层Rf值及斑点颜色 均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为獐芽菜苦苷。

19

北京化工人学硕l:学位论文

化合物7



白色粉末状结晶,mp.113-115"C,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish 反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。与标准品獐芽菜苦苷共薄层Rf值及斑点颜色 均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为獐芽菜苷。

化合物8




白色粉末状结晶,mp.126.128。C,10%H2S04乙醇显色呈粉红色斑点,Molish 反应呈阳性。(.)ESI.MS给出准分子离子峰375.0【M—H】+,结合13C—NMR谱和
DEPT谱推出分子式为C16H240lo。 1H-NMR谱中,低场氢信号67.40(1H,s)为连氧烯氢的信号;其与较低场信 号65.29(1H,d,J=4.2Hz)为环烯醚萜的特征信号;64.68(1H,d,J=7.8Hz)为糖端

基的氢信号;低场处61.11(3H,d,J=6.6Hz)为甲基的氢信号。 13C.NMR谱中,8169.9处的信号为羰基碳信号;6150.9和6113.0两处的信 号为烯碳信号;高场612.1处的信号为甲基信号。B76.9.661.4范围内的信号除去 环烯醚萜环上的一个信号外,剩余的5个信号为糖的信号,从其化学位移来看应 含为葡萄糖,进一步对其进行酸水解,检出葡萄糖。 在HSQC谱中,甲基氢信号61.1l(3H,d,J=6.6Hz)与碳信号612.1存在直接
相关;?54.68(1H,d,J=8.4Hz)的氢信号与698.6处的碳信号存在直接相关,为葡

萄糖的端基信号,氢信号的偶合常数J=7.8Hz说明端基构型为声型;896.2处的

第三章麻仡秦艽的化学成分研究

碳信号与65.29(1H,d,J=4.2Hz)的氢信号存在直接相关,是环烯醚萜的l位信号, 也是环烯醚萜化合物的特征信号。HMBC谱中,898.6处的碳信号和65.29(1H,d,

J---4.2Hz)的氢信号存在远程相关,说明葡萄糖l位成苷。

将1H.NMR的数据和13C-NMR的数据与文献洲报道的落干酸的数据对照基
本一致;结合HSQC谱和HMBC谱分析,确定此化合物为落干酸。其信号见Table
3.5。

化合物9



白色粉术状结晶,比旋光度[0【】D26.111.5。(c=1.36,MeOH),10%H2S04乙醇
显色呈紫红色斑点, Molish反应呈阳性。

1H-NMR谱中,67.47(1H,s)为一连氧烯氢信号;其与65.64(1H,s)为环烯 醚萜的特征信号;65.81(1H,m)、85.66(1H,d,J=3Hz)、65.28(1H,m)和65.24(1H, m)这几组信号为烯氢信号。由以上分析可推测出化合物9为龙胆苦苷型化合物。 13C.NMR谱中,信号i5164.9处为羰基碳信号,8149.4—8103.5之问的六个碳 信号应为烯烃上碳。876.6.661.3之间的11个碳信号除去环烯醚萜母核上的1个 碳外,其与10个碳为糖的信号,由其化学位移特征推测为葡萄糖,进一步对化

合物9进行酸水解,检出葡萄糖,由此可以确定分子内连有两葡萄糖;氢信号的
偶合常数分别为J=8.4Hz和J=7.8Hz,说明端基构型均为∥型。

将化合物的1H.NMR的数据和13C.NMR的数据与文献【32】报道的 6’.D-伊D—glucosylgentiopicroside的数据对照基本一致;故鉴定该化合物为
6’.D.伊D.glucosylgentiopicroside。其氢碳信号见Table
3-5。

表3—5化合物8和化合物9的核磁数据(CD30D)
NO 8 9 6c 96.2 150.5 113.0 30.8 6H 6c 97.4 149.4 103.5 125.6

6H
l 3 4 5 6

5.29(1H,d,J=4.2Hz) 7.47(1H,s)


5.64(IH,s) 7.47(1H,s)

3.12(1H,m)

1.68(1H,m)41.3

5.66(1H,d,J=3Hz)

115.8

2l

北京化工人学顺{:学位论文

2.26(1H,m)
7 8 9 10

4.06(1H,s)

73.7

5.07(1H,m) 5.04(1H,m)

69.5

1.94(1H,m)40.7 2.05(1H,m)
45.1 12.1

133.8

5.8l(1H,m)48.5 5.28(IH,m) 5.24(1H,m)
117.4

1.11(3H,d,J=6.6Hz)

11 Glc l’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’

169.9 98.6 73.3 76.6

164.9 103.6 73.0 76.O 70.1 76.6

4.68(1H,d,J=7.8Hz)

4.68(1H,d,J=8.4Hz) 3.18(IH,m)

3.30(1H,m) 3.90(1H,dd,J=12,1.8 Hz) 3.69(1H,d,J=12Hz)

70.2 76.9 61.4

4.20(1H,dd,J-12,1.8 Hz) 3.78(1H,dd,.『=12,1.8 Hz)

68.6

Glc l,, 2,, 3” 4" 5,, 6”

4.40(I H,d,J=7.8Hz)
3.22(1H,m)

99.O 73.7 76.4 69.9 76.6 61.3

3.89(1H,dd,J=12,1.8 Hz) 3.69(1H,dd,J=12,1.8 Hz)

化合物10



O=C OH OH

白色粉末状结晶,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性, 酸水解检出葡萄糖。与对照品2'-O-(2.3-dihydroxyl—benzoyl)一sweroside共薄层Rf 值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为2'-O.(2,3一dihydroxyl-
-benzoyl)一sweroside。

第三章麻花秦艽的化学成分研究

化合物”





白色粉术状结晶,mp.132.134"(2,10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish 反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。

1H.NMR谱中,低场氢信号67.62(1H,s)和66.53(1H,s)提示分子中含有一
个2,4,5.三取代苯环【川;较低场信号66.41(1H,d,J=10.2Hz)、55.67(1H,d,

J=10.2Hz)为双键上的氢信号。63.79(3H,s)处的信号为甲氧基的信号;60.85(3H,
s)和60.87(3H,s)为两个甲基的信号。 13C-NMR谱中,信号6162.9处为羰基碳信号,8149.4.5100.9之间的8个碳

信号应为苯环上和双键上信号。828.4和528.5处为两个甲基的信号,其化学位
移偏向于低场,说明两个甲基临位有吸电子基团。878.0.860.9之间的10个碳信

号为两个糖的信号,由其化学位移特征推测为葡萄糖,进一步对化合物进行酸水
解,检出葡萄糖,由此可以确定分子内连有两葡萄糖;1H.NMR谱中,65.48(1H, d,J=7.8Hz)和64.32(1H,d,J=7.8Hz)为葡萄糖的端基氢信号,从其偶合常数来 看,两个葡萄糖的端基构型均为∥型。

将化合物的1H-NMR的数据和13C.NMR的数据与文献【9】报道的
macrophylloside

D的数据对照基本一致;故鉴定该化合物为macrophylloside

D。

其碳谱信号见表3-6。

化合物12

gl



白色粉末状结晶,mp.245-248"C,10%H2S04乙醇显色呈粉红色斑点,Molish 反应呈阳性,FeCl3反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。

j匕京化工人学硕}:学位论文

13C.NMR谱中,出现17个信号,在861.4.877.67范围内为糖的碳信号,结 合分离过程中化合物的极性来看,分子中应含有两个糖;13C.NMR谱中只出现
了一个糖的信号,说明分子是对*峁梗舜磐贾兄桓艘话虢峁沟男藕拧

1H-NMR谱中,低场氢信号66.67(4H,s)为苯环上的氢信号,说明分子中含
有两个四取代苯环,且苯环上的两个芳香氢处于间位或对位;较高场区信号63.76 (12H,s)为4个甲氧基的氢信号。 13C.NMR谱中,6153.1.6104.8内碳信号为苯环上的信号;856.9和854.1为 甲氧基上的碳信号;在870.44.877.67范围内出去糖的4个信号外,还含有一个

连氧碳信号;885.5处的信号为连氧碳信号,且此位置的碳还应与共轭基团相连 接,是木质素的特征信号。将化合物的1H-NMR的数据和13C.NMR的数据与文

献[8'33搬道的(一).syringaresinol一4,4'-bis-fl-O-D—glucopyranoside的数据对照基本
一致;故鉴定该化合物为(-)-syfingaresin01.4,4’-bis-fl-O-D—glucopyranoside。其碳
谱信号数据见表3-6。

化合物13

无色针状结晶,mp.262.263"C,FeCl3反应呈阳性,紫外下有强的吸收。 ‘H.NMR谱中,低场氢信号68.56(1H,d,J=8.4Hz),88.43(IH,d,J=8.4Hz)和

67.92(1H,t,J=8.4Hz)说明分子中含有一个1,2,3.三取代苯环;低场氢信号68.01 (1H,s)为五取代苯坏上的氢信号;高场63.53(2H,t,J=6.0Hz)处为连氧仲碳的两 个质子的信号,其临位的氢信号的化学位移为64.68(2H,t,J=6.0Hz)。
13C-NMR谱中,出现了15个信号;低场区8164.7和8163.6这两处为羰基

的碳信号信号:8139.1.8121.2范围内碳信号为芳碳的信号,有10个信号,说明 两个苯环可能骈合;较高场区869.6和867.1为连氧碳的信号。
将化合物的1H.NMR的数据和13C-NMR的数据与文献【8】报道的

gentiaphyllide—D的数据对照基本一致;故鉴定该化合物为gentiaphyllide—D。其碳
谱信号数据见表3-6。

24

第三章麻花秦艽的化学成分研究

化合物14

OH H O

O OCH3

无色粉术状结晶,mp.110—112℃,10%H2S04乙醇显色呈紫色斑点,Molish
反应呈阳性,FeCl3反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。 1H.NMR谱中,低场氢信号810.05(1H,br s)为活泼氢的信号;67.40(1H,d, J=7.8Hz),67.35(1H,d,J=7.8Hz)和66.85(1H,t,J=7.8Hz)这组信号说明分子中

含有一个1,2,3.三取代苯环;84.84(1H,d,J=7.2Hz)处的信号为糖的端基信号;
63.87(3H,s)为甲氧基的信号。 13C.NMR谱中,出现了13个信号;低场区6169.1处为羰基的碳信号; 8150.3.8115.0范围内碳信号为苯环上碳的信号;8101.7为糖的端基碳信号,

577.6.661.2范围内的信号为糖上的碳的信号,由其化学位移特征推测为葡萄糖,
进一步对化合物14进行酸水解,检出葡萄糖;氢信号的偶合常数J=7.2Hz,说明 端基构型均为∥型。852.8为甲氧基的碳信号。 由以上分析可以推测出分子中含有一个三取代苯环,一个羰基基团,一个甲 氧基基团和一分子的葡萄糖;且取代基团处于苯环上的1,2和3位。将化合物

的1H.NMR的数据和13C-NMR的数据与文献【8,341报道的gentiaphyllide.E的数据
对照基本一致;故鉴定该化合物为gentiaphyllide.E。其碳谱信号数据见表3-6。
表3-6化合物ll、12、13和14的13C.NMR数据(DMSO-d6) Table 3-6 13C.NMR data of compound II,12,13 and 14(DMSO.d6) !Q堕卫壁坚翌堕
ll NO. 1 2 3 4 5 6 7 l’ 27 3’ 4’ 5’ 1” 2” 3” 4” 5” 6” 12 13 14

6c
1 13.5 161.8 100.9 158.4 111.0 130.4 162.9 129.2 121.0 78.0 28.5 28.5 94.6 72.9 77.3 70.4

No. 1.1’ 2.2’ 3,3


6c
134.3 104.8 153.1 137.6 153.1 104.8 54.1 71.8 103.2 74.7 77.0 70.4 77.7 61.4 56.9 56.9 56.9

NO. 1 3 4 4a 4b 5 5a 5b 6 8 8a 9 10 ll 1la


164.7 67.1 23.8 139.1 123.1 121.2 127.6 131.3 69.6 163.6 121.4 131.8 128.3 130.4 129.2

NO. l 2 3 4 5 6 7 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’


l 15.0 150-3 146.4 123.4 119.2 121.3 169.1 101.7 73.7 76.9 70.2 77.6 61.2 52.8

4.4’ 5.5’ 6.7’ 8.8’ 9.9’ 1”.1’” 2”.2”’ 3”.3”’ 4”.4”’ 5”.5”’ 6”.6”’

7.7’85.5

OMe

76.8
69.8

OMe.3 OMe一3’ OMe一5

北京化『[人学顾一lj学位论文

化合物15



无色针状结晶,遇光后变砖红色,mp.145.147"C。10%H2S04乙醇显色呈
紫色斑点。 1H-NMR谱中,低场氢信号810.22(1H,s)为醛基氢的信号;68.39(1H,d, J=7.8Hz),68.05(1H,d,J=7.8Hz)和67.63(1H,t,J=7.8Hz)这组信号说明分子中

含有一个1,2,3.三取代苯环;高场63.59(2H,t,J=6.0Hz)处为连氧仲碳的两个质
子的信号,其临位的氢信号的化学位移为64.56(2H,t,J=6.0Hz)。

13C-NMR谱中,出现了10个信号;低场区8191.9和8164.2这两处为羰基
的碳信号信号;8141.1.15127.0范围内碳信号为苯环上的6个信号;较高场区866.7 为连氧碳的信号。

将化合物的1H-NMR的数据和13C-NMR的数据与文献[101报道的 erythrecentaurin的数据对照基本一致;故鉴定该化合物为erythrecentaurin。
化合物15的波谱数据如下:1H-NMR(CDCl3):3.59(2H,t,J=12Hz,H一3), 4.56(2H,t,J=12Hz,H一4),8.39(1H,d,J=7.8Hz,H一6),8.05(1H,d,J=7.2Hz, H-7),7.63(1H,t,J=7.8Hz,H-8),10.22(1H,s,H-10),;¨C-NMR(CDCl3): 164.2(C一1),66.7(C?3),24.6(c-4),132.6(C-5),138.5(C-6),127.8(C一7),135.7 (C一8),126.9(C-9), 141.1(C一10), 191.9(C一11)。

第二三章麻花秦艽的化学成分研究

化合物1



无色针状结晶,mp 178~-180℃,10%H2S04乙醇显色呈粉红色斑点,TLC

展开时不加酸有拖尾现象,Lieberman.Burchard反应呈阳性。与栎瘿酸对照品共 薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为roburic
化合物1 7
acid。

H20H

HO

白色针状结晶,mp 180~182℃,10%H2S04乙醇显色呈褐色斑点, Lieberman.Burchard反应阳性。与乌苏醇对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,
混合熔点不下降,故鉴定该化合物为乌苏醇。

化合物1 8

HO H



无色颗粒状结晶,mp 290"~293℃,10%H2S04乙醇显色呈褐色斑点, Lieberman.Burchard和Molish反应均呈阳性。与胡萝卜苷对照品共薄层Rf值及 斑点颜色均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为胡萝b苷。

北京化工人学硕七学位论文

化合物1 9

Ho 无色粉末状结晶,mp 137~139℃,10%H2s04乙醇显色呈褐色斑点, Lieberman.Burchard反应呈阳性。

1H.NMR谱中,氢信号65.33(1H,s)为烯氢的信号;83.55(1H,m)为连氧碳 上氢的信号;在高场区出现多个甲基信号,说明该化合物可能是植物甾醇或三萜
类化合物。 13C.NMR谱中,6128.0和8121.7处的信号为双键上的信号;871.8为连氧碳

的信号;在高场区出现多个信号,进一步印证化合物可能是植物甾醇或三萜类化
合物。 将化合物的1H-NMR的数据和”C.NMR的数据与文献【35】报道的fl-sitosterol

的数据对照基本一致;故鉴定该化合物为fl-sitosterol。
化合物19的波谱数据如下:1H-NMR(CDCl3):3.55(1H,m,H.3),5.33(1H, s,H一6),0.68(3H,s,H-18),0.92(3H,s,H-21),0.82(3H,d,J=4.8Hz,H-26), 0.81(3H,d,J=4.8Hz,H-27),0.86(3H,t,J=7.2Hz,H-29);1,C-NMR(CDCl3): 37.2(C-1),31.9(C一2),71.8(c-3),42.3(C-4),140.7(c-5),121.7(C一6),29.7(C一7), 31.9(C一8),50.1(C-9),36.1(C一10),21.1(C-11),28.2(C-12),42.3(C一13),56.3 (C一14),24.3(C一15),39.7(C一16),56.0(C一17),14.1(C一18),21.0(C一19),36.5(C一20), 19.O(C一21),33.9(C-22),26.0(C一23),45.8(C一24),29.1(C一25),19.0(C-26),22.7 (C一27),24.3(C-28),11.9(C一29)。

化合物20 OH OH



28

第三章麻花秦艽的化学成分研究

无色颗粒状结晶,mp 208~210℃,10%H2S04乙醇显色呈黑色斑点,Molish 反应呈阳性。(+)ESI.MS给出准分子离子峰527.0【M+Na]+,结合13C.NMR谱推
出分子式为C18H32016。 ”C.NMR谱中,出现了18个信号,从其化学位移来看像葡萄糖或果糖的信 号;其中,6103.7,6102.8和692.1为糖的端基信号,662.5,661.4和660.8为糖 的6位碳上的信号。1H-NMR谱中,65.34(1H,d,J=3.6Hz)和64.21(1H,d,J=8.4Hz)

为糖的端基氢信号,从偶合常数来看,构型应该有一个∥型。将化合物进行酸水
解检出伊葡萄糖、a.葡萄糖和织.果糖。

将化合物与gentianose对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不
下降,并结合核磁数据鉴定该化合物为gentianose。

化合物21

H OH

无色颗粒状结晶,10%H2s04乙醇显色呈黑色斑点,mp 150"-"152℃,Molish

反应呈阳性。(+)ESI.MS给出准分子离子峰202.9【M+Na]+,结合13C.NMR谱推
出分子式为C6H1206。

bC.NMR谱中,从各个信号的化学位移来看像葡萄糖糖的信号,896.0处为 糖的端基信号;860.8为糖的6位碳上的信号。1H.NMR谱中,64.58(1H,d,J=7.2Hz) 为糖的端基氢信号,从偶合常数来看,应为∥型。
将化合物的1H.NMR的数据和13C-NMR的数据与文献[36】报道的C-glucose

的数据对照基本一致;同时将化合物与p-glucose对照品共薄层Rf值及斑点颜色 均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为p-glucose。

化合物22

H H

无色颗粒状结晶,10%I-t2S04乙醇显色呈黑色斑点,mp 150"--152℃,Molish 反应呈阳性。(+)ESI.MS给出准分子离子峰202.9[M+Na]+,结合13C-NMR谱推

29

北京化工人学顾l:学位论文

出分子式为C6H1206。
13C.NMR谱中,从各个信号的化学位移来看像葡萄糖糖的信号,692.1处为 糖的端基信号;660.6为糖的6位碳上的信号。1H.NMR谱中,65.17(1H,s)为 糖的端基氢信号,从偶合常数来看,应为仅型。 将化合物的1H.NMR的数据和13C.NMR的数据与文献f36】报道的a.glucose 的数据对照基本一致;同时将化合物与仅.glucose对照品共薄层Rf值及斑点颜色

均一致,混合熔点不下降,故鉴定该化合物为仅.glucose。

3.3结果与讨论
从麻花秦艽的根中分离得到23个化合物,通过理化性质和波谱方法鉴定了 22个化合物;其中环烯醚萜类化合物10个:7(S).n-butyl morroniside(1)、7
(R)一n-butyl
morroniside

(2)



6'-O-acetyl

genfiopicroside

(3)



6'-O-(2-hydroxy-3-O—pD-glucopyranosyl—benzoyl)一sweroside(4)、gentiopicroside (5)、
swertiamarin

(6)、

sweroside

(7)、logannic

acid

(8)、

6’一D毋D-glucosylgentiopicroside(9)、2’一O-(2,3一dihydroxyl-benzoyl)一sweroside(10);
三萜类化合物2个:roburic acid(16)和uvaol(17);植物甾醇类化合物2个: daucosterol(18)和fl-sitosterol(19);糖类化合物3个:gentianose 20)、fl-glucose(21) 和仅.glucose(22);Chromene类化合物1个:macrophyiioside D(11);木质素类
化合物1个:(一)-syringaresin01.4,4’-bis-fl-O.D—glucopyranoside(12);苯甲酸衍生

物类化合物1个:genfiaphyllide—E(14);其他类化合物2个:gentiaphyllide—D(13)
和erythrecentaurin(is)。 在这些分离得到的化合物中,化合物1、3和4是新化合物;化合物2为首

次由龙胆属植物分离得到的化合物;化合物6、7、8、9、1 16和20为首次由麻花秦艽中分离得到的化合物。

l、12、13、14、15、

通过植物化学成分的研究,可以对植物和药材的化学分类有很大的帮助。龙 胆科植物广泛分布于温带区域,大概有80属1000多种植物;其中龙胆属和獐 芽菜属植物是龙胆科主要种属植物。研究表明,龙胆属和獐芽菜属植物含有大量 的环烯醚萜和裂环环烯醚萜化合物,这些化合物被认为是这两属植物的生理活性 物质【37枷1。由于多种龙胆属和獐芽菜属植物都含有部分环烯醚萜类化合物,所以 这些化合物并不具有化学分类和系统分类特征;如龙胆科植物Gentiana
Maxim.、Gentiana tibetica
algida

Pall.、Gentiana linearis Froel.、Gentiana scabra Bge.、Gentiana schistocalyx K. Koch、Gentiana siphonanf7la King
eX

Hook.£、Gentiana

uchiyamana Nakai—Swertia bimaculata Hook.£et Thorns.ex Clarke.、Swertia punicea

Hemsl.和Swertia

catycina

Franch.中均含有龙胆苦苷【32'37,41431;獐芽菜

第三章麻花秦艽的化学成分研究

苷,另一种比较重要的环烯醚萜类化合物,在Swertia
calycina,Swertia rhodantha
cincta

chirata Buch.Ham.、&

Burk.,g

siphonantha、暖macrophylla,Gentiana

Franch.和G.tibetica这些植物中也均含有此化合物【37,41m】。通过我们的

研究发现,化合物1.4都是首次从龙胆属植物中分离得到,由于这些化合物结 构上的特殊性,如化合物l和2是morroniside型环烯醚萜且含有丁基基团、 化合物3只有葡萄糖6位乙酰化、化合物4苯基基团连在葡萄糖的6位且葡 萄糖没有乙酰化等,可以将上述四种化合物作为龙胆科,尤其是龙胆属植物中药 的化学分类物质。

通过系统的查阅文献,大叶秦艽中也含有化合物5.10等环烯醚萜类化合物; 化合物11.22等非环烯醚萜化合物在大叶秦艽中同样存在…01,由此可以看出大 叶秦艽和麻花秦艽不仅都含有龙胆苦苷,在非环烯醚萜成分方面亦十分相似。《中 国药典》将麻花秦艽列入秦艽原植物中是科学的,麻花秦艽和大叶秦艽可以相互
替代使用。 在对麻花秦艽化学成分研究的过程中,虽然取得了不错的成果,但也存在柱

色谱分离效率不高的问题,麻花秦艽中的主要化学成分为环烯醚萜类化合物,用
薄层色谱检测时比移值Rf比较的接*,在硅胶柱色谱上分离纯化出单体化合物 很难;由于物理化学性质的相*,即使用ODS柱色谱,Sephadex LH一20柱色谱

也很难分离;同时在进行柱色谱分离时,耗时比较的长,样品量大一些的硅胶柱 就得花费两周的时间,ODS柱用时更多;劳动强度也较大。可以尝试用柱效更
高的制备液相或高速逆流色谱进行秦艽的化学成分研究。

3l

第叫章秦艽环烯醚萜类化合物的生物活性研究

第四章秦艽环烯醚萜类化合物的生物活性研究
炎症、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病和糖尿病、癌症、 冠心病等疾病的的发生发展均与自由基密切相关【451,如果能适当的找到抑制或清 除自由基的抗氧化剂,则可以缓解或治愈相关的疾病。秦艽是中医治疗风湿麻痹, 类风湿性关节病必不可少的药物;通过前人和我们的研究发现环烯醚萜类化合物
是秦艽主要的化学成分,其也可能是秦艽发挥药效作用的物质基础。为了解秦艽

抗炎机制以及揭示秦艽发挥药效作用的物质基础,本章节对从麻花秦艽中分离分
离得到的6’一0一(2-hydroxy-3一D—伊D-glucopyranosyl—benzoyl)一sweroside(HBS)、 gentiopicroside(GTP)、 swertiamarin(STM)、 sweroside(STS)和

6’-D_伊D—glucosylgentiopicroside(GGT)五种环烯醚萜化合物对人中性粒细胞自

由基产生作用的影响进行了研究;同时对五种化合物对红细胞膜脂质过氧化的保 护作用、溶血试验以及化合物6'-0-(2-hydroxy.3一D伊D-glucopyranosyl -benzoyl)一sweroside(HBS)和gentiopicroside(GTP)对二甲苯所致小鼠耳肿胀的 影响进行了研究。

4.1化合物对人中性粒细胞自由基产生作用的影响
4.1.1中性粒细胞NADPH氧化酶简介

中性粒细胞(PMNs)是天然免疫系统的重要组成部分,是生物体抵抗病原 体入侵的第一道防线,约占外周血白细胞总数的50—80%。当生物体受到外来病 原体入侵时,在趋化因子的作用下,作为最先响应的免疫细胞,通过脉管系统, 很快聚集到受感染部位,直接发挥非特异性的杀菌作用【4酬。研究发现当中性粒细 胞进行吞噬或被一定炎症因子刺激时,氧消耗显著增加,这一现象称为呼吸爆发
【47】


氧的消耗是由中性粒细胞产生02一而引起的,产生O厂的过程是一个非常 复杂的生化过程,催化这一过程的酶被称为NADPH氧化酶(NADPH oxidation),也被称为呼吸爆发氧化酶。NADPH氧化酶广泛存在于中性粒细胞、 碱性粒细胞以及单核细胞中,在其催化下,分子氧被还原为02一,此外还生成
HOCl、H202和OH?等活性物质。

NADPH氧化酶主要包括五个组分:p4扩似(p:protein,PHOX"phagocyte
oxidation)、

p47删、 p67删、p22册Ⅳ以及gp9 1删Ⅳ(gp:glycoprotein)。

p22朋似和gp9l删似为膜蛋白,在中性粒细胞分泌小泡或特异的颗粒膜表面形

北京化1二人学硕一J:学位论文

成异源二聚体,即细胞色素b558。NADPH的电子就是通过它的两种辅基由黄

素蛋I兰tFAD经血红素转移到02上的。p40尸删、p47删似和p67州倒通常以复
合物的形式存在于中性粒细胞的胞质内,这三种蛋白均含有SH3结构域,此外,

在p67朋似的N末端及p47删甜的C末端还含有富含脯氨酸的sH3结合结构 域。当中性粒细胞处于静息状态时,p47朋似的这两个结构域相互结合使其无法
转移至膜与细胞色素b558作用。细胞激活后,p47朋似的C木端SH3结合结

构域与p67删似的C末端sH3结构域结合从而将其自身的sH3结构域释放
出来。释放出的SH3结构域既可在胞质内和p67朋似的N末端SH3结合结构 域作用,又可转移到膜上和p22删*岷稀=撇猓危粒模校妊趸傅幕罨

可能伴随着胞质复合物的重新排列。除以上五种蛋白外,两种鸟苷酸结合蛋白(G
蛋白)也参与了NADPH氧化酶的活化。一种是Rac2,属于G蛋白Rho家

族,存在于静息状态的中性粒细胞胞浆内,当其与GTP结合后随p4俨似、
p47朋似和p67朋似一同转移到膜上,促进p67朋锻与细胞色素b558之间的相
互作用;

一种是RaplA,属于Ras家族,定位于中性粒细胞膜表面,与细胞

色素b558结合[45,48】。

中性粒细胞NADPH氧化酶的激活是一个非常复杂的生化过程,包括受体 依赖性和非受体依赖性两种机理。前者常见的刺激剂是
fMLP

州.formyl.methionyl.1eucyl.phenylflanine,N.甲酰蛋氨亮氨酰苯丙氨酸)、OPZ
(Opsonized

zymosan,调理素)、免疫复合物等,后者的刺激剂有AA(Arachidonic

acid,花生四烯酸)和PMA(Phorb01.12.myristate.13.acetate,佛波醇.12.十四烷 酸酯。13一乙酸酯);其中fMLP、PMA和AA分别是激活phospholipase D、激活
Proton Kinase

C和直接或间接诱导p47朋似和p22朋甜的相互结合从而激活

NADPH氧化酶【4引。

4.1.2实验步骤[50,s1] 中性粒细胞的分离:健康入外周血20 ml+3.8%枸橼酸钠(9:1)加入到
Polymoyphprep血细胞分离剂中,1800 rpm离心分离出白细胞层,再以KPR缓

冲溶液洗涤两次;最后将中性粒细胞重新悬浮于KPR缓冲液中,浓度为1×108 个/ml,置于冰浴中待用。 自由基产生的测定:中性粒细胞产生的自由基可以还原细胞色素C,细胞
色素C的还原可以使其在一定波长处的吸光度发生改变,所以通过检测吸光度

的改变来测定自由基的产生。以岛津UV.3000双波长分光光度计在37℃连续 搅拌的情况下测定反应混合物吸光度的变化。标准混合物包括lxl06个中性粒细

第pq章秦艽环烯醚萜类化合物的生物活性研究

胞、l mM

CaCl2、20

pM细胞色素C、10 mM葡萄糖、O一50 llM的样品以及刺

激齐U(12.5 nM fMLP,l pM PMA,10 nM AA),再以KRP缓冲液将体积调制2 ml, 反应混合物先预热3分钟,然后分别加入上述三种刺激剂,开始测定吸光度在
550.540

nm的差值的变化,连续测定4分钟。

4.1.3结果与讨论

1化合物对fMLP诱导人中性粒细胞自由基产生作用的影响 化合物对fMLP诱导人中性粒细胞自由基产生作用的结果如图4.1所示;由 图可以看出所测试的5种化合物均对fMLP诱导人中性粒细胞自由基的产生显示 抑制作用,并成浓度依赖关系。 5种裂环环烯醚萜化合物的作用强度为GGT>GTP>HBS>STs>STM(50

州);从化学结构来看,5、6位的氧化情况对其作用强度有较大的影响,化合物
GGT和GTP的5、6位为双键,还原性大于化合物HBS和STS的单键,5位为

羟基取代时,还原性最小。 另外,葡萄糖的个数也对作用强度有一定的影响,化合物GGT有两分子的
葡萄糖,其作用强度大于含有一分子葡萄糖的GTP。HBS和STS的母核相同,

其分子中的芳香部分可能对作用强度有一定的影响,使得HBS的作用强度大于
STS。

Fig.4-1 Effect of compounds

图4-1化合物对fMLP诱导人中性粒细胞自由基产生作用的影响 on the fMLP-induced superoxide generation in human
neutrophils

35

北京化T大学倾}。学位论卫

2化合物对PMA诱导人中性粒细胞自由基产生作用的影响 化合物对PMA诱导人L}l性粒细胞自山基产生作用的结果如图4.2所示;由
罔可以看出所测试的GGT、STS和STM三种化合物对PMA诱导人中性粒细胞

自山基的产生无明显作用:HBS和GTP对PMA诱导人中性粒细胞自由基的产
乍有抑制作用,并成浓度依赖关系。 HBS和GTP作用抽i度为HBS>GTP,化台物HBS分子中的芳香部分-U能对

作用强度有较大的影口虮

圉4—2化合物对PMA诱导人中性粒细胞自由基产生作用的影响
Fig.4-2Effectof compounds onthePMA-induced superoxide generationin humaa

…trooillls

3化合物对AA诱导人中性粒细胞自由基产生作用的影响 化合物对AA诱导人中性粒细胞自由基产生作用的结果如图4—3所示;由图

可以看出所测试的GGT、STS和STM三种化合物对AA诱导人中性粒细胞自由

基的产生无明显作用:HBS和GTP对从诱导人中性粒细胞自由基的产生有抑
制作用,并成浓度依赖关系。

HBS和GTP作用强度为HBS>GTP,化台物HBS分子中的芳香部分可能对
作用强度有较大的影响。

类风湿性关节炎是一种病凼尚未明了的慢性全身性炎症性疾病,其发病和发
展与自山基有着密切的关系。秦艽作为中医治疗风湿麻痹,类风湿性关竹病必不

ur少的药物,其作用机理尚不明确。通过我们的研究可以表明,秦艽具有治疗类 风湿性关竹炎的疗效可能是由r秦艽一p的活性成分对自由基的产生进行了抑制.

第pq章辜艽坪烯鹱萜粪化台物的生物活性研究

进而减少了自由基对宿主组织细胞的伤害,达到减缓或治愈疾病的作用。

圈4-3化合朝对AA诱导人中性粒细胞自由基产生作用的影响

№“8“““”““::裟掣“”“”“”“““ neⅡtmOhlB


2化合物对红细胞膜脂质过氧化的保护作用的研究

4.2.1脂质过氧化简介

脂质过氧化是广泛发生在植物和动物中的复杂的生化反应,一般将不饱和脂 肪酸的氧化变质称为脂质过氧化。脂质过氧化包括自由基的产生,不饱和键的重 排以及不饱和脂肪酸的破坏等过程;该过程生成乙醇、乙醚和酮类等产物阻}。红 细胞的细胞膜含有高浓度的血红蛋白,在一定的条件下可以刺激脂质过氧化物的 分解,释放铁离子促进腊质过氧化和产生羟基自由基;产生的自由基会破坏蛋白、 核酸和细胞膜等【5”。红细胞不能进行生物合成,膜脂和膜蛋白得氧化损伤无法修

复。红细胞的脂质过氧化可能造成地中海贫血和自身免疫溶血等疾病洲。化合物
对人中性粒细胞产生自由基的研究表明5种化合物具有不同程度自由基清楚作 用.因此研究5种化合物是否对红细胞膜的脂质过氧化有保护作用。



2.2实验步骤”55】
红细胞膜的分离:健康人外周血20
m1-3

8%枸橼酸钠(9:1)加入到

北京化T人学硕士学位论文

Polymoyphprep血细胞分离剂中,1000 rpm离心分离出红细胞层,再以3倍体 积的150 mM NaCl和5 mM PBS缓冲溶液洗涤3次;红细胞与20倍体积的5 mM Na2HP04在4。C下30000 rpm离心得到红细胞膜;以5 mM Na2HP04溶液洗涤膜

4次,最后膜蛋白以生理盐水配制到l

mg/mL。

脂质过氧化的测定:以硫代巴比妥酸(TBA)法测定脂质过氧化的程度。TBA 法是利用TBA与脂质过氧化的最终产物丙二醛反应,在PH 3.0左右加热生成红 色产物,在532 nln处有一特征吸收,通过分光光度计测定反应混合物吸光度来 表征脂质过氧化物的含量,进而确定脂质过氧化的程度。反应混合物包括1
的膜蛋白溶液、2 mL的TCA.TBA—HCl试剂、3 mM
H202、5 mL

mM FeS04以及0.100

1.tM的样品。反应混合物在37℃的条件下反应30 min,冷却,1000 rpm离心10
min,上清液测定吸光度。

4.2.3实验结果

研究结果表明,测试的5种坏烯醚萜化合物虽然具有不同程度的清楚自由基 地作用,但对红细胞膜的脂质过氧化无明显的保护作用。

4.3化合物的溶血试验
实验方法:健康人的新鲜*20 ml+3.8%枸橼酸钠(9:1),1000 rpm离心分
离出红细胞层,2倍体积的生理盐水洗涤2次,然后将红细胞重新悬浮于生理盐

水中,得到10%的红细胞悬浮液。取O.25 ml该悬浮液,加入等体积的不同浓 度的各种环烯醚萜的生理盐水溶液。轻微震荡37℃下恒温5 min,然后l
100 rpm

离心5 min。取0.2 ml的上清液,加入3.3 ml的去离子水,550 nln处测定吸光度。 溶血百分比以下式计算:H%=Asample/A100×100%;其中A100为全溶血时的吸光 度,即0.25
ml 10%的红细胞悬浮液加入到8.5

m1的去离子水中,37℃水域5

min

后测定的吸光度。 实验结果:实验显示5个环烯醚萜化合物50 gM和100 gM时均不显示溶血 作用(图4.4),100 lxM的浓度要明显高于化合物显示抑制活性的浓度。这一结果

表明,如果这5个环烯醚萜类化合物应用于临床,将不会出现溶血作用。

鹕日章誊艽环烯醚帖类北合物的生物活性研究

i卜■蹴
№4-4Hemolytte effectoffive compounds


图4-4化音物的溶血作用

4对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
通过我们对麻花秦艽化学成分发现化合物HBS这种结构新颖的化合物在麻

花秦艽药材中的含量比较高;化合物IiBS对人中性粒细胞自由基产生作用的影 响的研究表明其对不同刺激剂诱导的自由基产生具有不同程度的抑制作用,对 PMA和AA诱导的自由基的抑制作用强于秦艽的主要成分龙胆苦苷(GTP):由此 可见化合物HBS有可能也是麻花秦艽发挥药效作用的重要物质基础。 中医临床将秦艽用于祛风湿、舒筋络、清湿热和利湿褪黄;抗炎与祛风通络 功效有着密切的作用。本节对麻花秦艽中化台物I-IBS和GTP的抗炎作用进行研 究,以探明这两种化合物是否能代表或部分代表秦艽生药的药理作用。 实验方法:昆明种小鼠80只,随机分为四组.即空白对照组、氢化可的松 阳性对照组、化合物GTP给药组和化合物HBS给药组。每天8:00点分别腹
腔注射化合物GTP、HBS、等体积的生理盐水和氢化可的松,每天1次,连续4

天.术次给药l 5小时后用二甲苯30山均匀涂于小鼠右耳两侧,30rain后处死 小鼠,剪下两耳,用9mm打孔器于两耳相同部位取下两耳片,置精密天*上称 重,计算肿胀度r肿胀度=右耳片重.左耳片重1。 实验结果和讨论:统*峁砻鳎馐缘幕衔铮龋拢雍停牵裕芯哂忻 显的对抗二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的作用(表4.1)。化台物HBS对小鼠耳肿胀的 抑制活性强于化合物GTP;化合物HBS的给药剂量为100 mg/kg时,效果接 *于20mg/kg的氢化可的松。

北京化丁人学硕’}:学位论文

不同给药途径时,药物对对小鼠耳肿胀的抑制活性不同,腹腔注射给药的效 果要优于灌胃给药。
表4.1化合物GTP和HBS对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响
Table 4.1 Efiect of compound GTP and HBS
on

auricula edema in mice

组别 生理氯化钠溶液 氢化可的松
GTP HBS

剂量/(mg/kg)


肿胀度/rag
17.6士2.21 7.1士1.13事 9.3士1.48* 7.8士1.52*

20 100 100

注:与生理氯化钠溶液相比较,。P<0.01

4.5小结
通过我们对麻花秦艽化学成分生物活性实验表明环烯醚萜类化合物对不同 刺激剂诱导的人中性粒细胞自由基产生作用有不同程度的抑制作用,其中对

蹦LP诱导的人中性粒细胞自由基的产生抑制作用最强;由此我们推测环烯醚萜
类化合物抑制了phospholipase D的激活,进而抑制了NADPH氧化酶的活化,

使得自由基的产生受到了抑制,减轻了对人正常组织细胞的损伤,达到减缓或治 愈疾病的目的。以上作用机理也可能是秦艽治疗风湿性关节炎的作用机理。 两种环烯醚萜类化合物对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有抑制作用,具有一定的 抗炎活性,这说明两种化合物与秦艽的祛风通络功效有着密切的作用,能够部分
的代表秦艽生药的药理作用。 体内和体外生物活性测试结果与麻花秦艽临床用药和药理方面相吻合,为进

一步对其进行研究开发奠定了一定的理论基础。

第五章秦艽的质量控制研究

第五章秦艽的质量控制研究
秦艽作为民间常用草药,*年来受到越来越多的关注;随着其临床用药量的

增加以及多年的过度采挖,造成了目前野生秦艽匮乏的现状。进行大面积的人工
引种栽培成为保护该药用植物资源的一项长久可行的措施pJ。为了保证人体用药 安全和人工栽培提供科学论据,需要对秦艽药材的质量标准严格控制。目前,中 国药典上将龙胆苦苷的含量作为秦艽的质量控制标准;但是中药的一大特点是成

分的复杂性和多组分协同起作用,不同产地的同种药材往往功效和品质各有不
同,这也表明中药的质量不能以单一的指标来评价。由于秦艽的化学成分复杂,

前人和我们研究发现秦艽中别的化学成分也有生物活性,龙胆苦苷这一单一化学 成分并不能代表秦艽发挥药理作用的物质基础。 国内的很多学者运用高效液相色谱法对秦艽化学成分中的gentiopicroside、
swertiamarin、sweroside和logannic acid四种环烯醚*辛硕坎舛ǎ郏担叮担埂浚 想以上述4种成分控制秦艽的质量,然而这4种成分广泛的存在于龙胆属其他植

物中【27‘60],以这4种化合物为质量标准并不能区分秦艽和其他药材;部分学者希
望以秦艽的指纹图谱作为质量控制的手段并进行了研究,但是只是单纯的指出了

几个共有峰,没有确定化合物的归属和具体含量【6L 62]。 秦艽药材科学的质量控制标准需要测定秦艽中化学成分的含量,尤其是环烯
醚萜类化合物。本研究建立了HPLC.UV/MS这一方法对秦艽中的7(S).n.butyl morroniside(1)、7(R)-n—butyl morroniside(2)、6’一O-acetyl gentiopicroside(3)、 6'-O-(2-hydroxy-3—07伊D-glucopyranosyl—benzoyl)-sweroside(4)、gentiopicroside(5)、 swertiamarin(6)、sweroside(7)、logannic acid(S)、6’一D-伊D?glucosylgentiopicroside(9) 和2’.D.(2,3.dihydroxyl.benzoyl).sweroside(10)等10种环烯醚萜的含量进行了测 定;该分析方法可以为秦艽质量标准的制订和资源的有效利用提供科学依据。

5.1测定方法的建立
5.1.1

HPLC和HPLC-MS的条件

高液相色谱仪使用岛津LC.20A(双泵,SPD检测器);色谱柱为Kromasil—C18
column(200×4.6 mnl
i.d.;5.0

lxm)检测波长为254 nn'l;流速:1 mL/mim柱温

为25"C;流动相为0.04%的磷酸水溶液(A)和甲醇(B),采用梯度洗脱,其梯度
变化如下:O.10 min,10.20%B;10.20 min,20%B;20.60 min,20.75%B。

HPLC.MS分析时,质谱仪为Quattro

Premier

XE(ESI离子源);Nebulizer、

41

北京化工人学硕I:学位论文

dry-gas和probe temperature分别设定在30 psi(nitrogen)、45 I/hr(nitrogen)和
350


oC;质谱扫描范围设定在m/z 100.1000;色谱柱为Kromasil.C1 8

column(200

4.6 mnl i.d.;5.0

pm);流速:1 mL/mim柱温为25"C;流动相为0.04%1拘甲酸水

溶液(A)和甲醇(B),流动相的梯度变化如上。 5.1.2标准曲线的制作

10种对照品通过前面提取分离得到,干燥至恒重,精密称量一定量置于容量 瓶中,甲醇超声溶解,定容;用甲醇稀释成6个浓度后置于冰箱中待用。标准溶
液在色谱条件下进样lOlxL测定色谱峰面积,每个浓度进样三次;以进样量为X 轴,色谱峰面积为Y轴外推法得到10种化合物的标准曲线;其结果见表5.1.
表5-1 10种化合物的标准曲线、线性相关系数、检测性和定量限
Table 5-1 Calibration curves,linear range,limit of detection and limit of quantification of ’ten reference compounds

5.1.3精密度试验

日内精密度取线性关系下的高中低3个浓度的标准溶液,进样lOlL,一天 内连续进样6次,测定峰面积值,计算相对标准偏差(RSD);日间精密度取线性 关系下的中等浓度的标准溶液,连续3天进样,每天2次,进样量lOlL,测定 峰面积值,计算相对标准偏差;其结果见表5。2。 5.1.4重复性和稳定性试验

制备6份麻花秦艽的供试液,每个供试液进样2次,进样lOlL,测定峰面

积值,计算相对标准偏差;以相对标准偏差的大小判断重复性。 麻花秦艽的供试液,在制备后的的0、2、4、6、8、12、24dx时时进样测定峰面
42

第五章秦艽的质量控制研究

积,计算相对标准偏差。重复性和稳定性见表5.2。
表5-2重复性、稳定性和精密度结果
■■■■■●■■●●■●■■■■■■■■■■■■■■■■●●■■■■■■■■■■■■■●■■■■■■■■■■●一m

Table 5-2 Repeatability.intra—day precisions,inter.day precisions and stability I■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■●■一 Repeatability

Compounds

RSD(%)]五厂—面面面广]匾广


Intra—day precisions

RSD(%)

inter—day precisions

Stability

RSD(%)

RSD(%)

5.1.5加样回收试验

取已知含量的麻花秦艽(样品1)药材适量,加入一定量的对照品溶液,按 照样品处理方法制备并进样lOlL,重复进样3次,计算各对照品的加样回收率,
并计算相对标准偏差,结果见表5.3。

表弼化合物的加样回收率结果
Table 5-3 Recoveries of ten bioactive components Compounds

Amount of analyte

Recovery(%)

RSD

竺旦坠!垒i翌曼旦f}鉴)
l 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.4568 0.0296 O.1094 0.3715 25.3564 1.1835 0.8860 4.2237 9.5412 0.8427

墨巳i堡里鱼!丛92
0.4537 0.1238 0.2237 0.3341 23.5 144 1.5513 0.7067 4.2607 8.61 18 0.5877

至Q旦旦堡!些92
0.9066 0.1519 0.3365 0.6978 48.1437 2.6813 1.6125 8.4736 18.3552 1.4464 99.1 98.9 101.5 97.7 96.9 96.6 102.8 99.7 102.3 102.7 2.39 4.65 3.66 1.28 2.87 3.45 1.72 4.22 4.60 3.73

5.1.6检出限和定量限的确定

检出限是指检测器能够检出物质的最小量或浓度;它与检测器的噪音有关,

一般以信噪比为3时相应的浓度或注入仪器的量确定检出限。定量限是指样 品中物质能被定量检测的最小量或浓度;一般以信噪比为lO时相应的浓度或
注入仪器的量确定检出限。

在高效液相色谱仪检测器稳定操作的条件下,不断地将预试液稀释,减少 对照品的进样量,直至色谱峰峰高为3倍或10倍时,确定各化合物的检测
线和定量限,其结果见表5.1。
43

北京化丁人学硕l:学位论义

5.2样品的测定
5.2.1样品的制备

样品1为采自甘肃省的麻花秦艽的根;样品2为采自内蒙古的麻花秦
艽的根;样品3为采自云南省的大叶秦艽的根;样品4为采自陕西省的大

叶秦艽的根;样品5为采自内蒙古的小秦艽的根。
将收集来的秦艽根部用超纯水洗净,晾干,研成细粉,精密称取1.0 置于锥形瓶中,加入1 5 ml甲醇,室温下浸提1.5小时,两次;合并滤液,


真空浓缩,浓缩液置于10 ml容量瓶中,甲醇定容,摇匀备用。

5.2。2样品的测定

将制得的样品液在相同的相同的色谱条件下作HPLC分析,每个样品 进样三次,根据每个化合物的色谱峰的面积计算化合物的含量,5种药材中 的各个化合物的含量见表5-4。
表5-4秦艽根中环烯醚萜化学成分的测定结果
Table 6 Contents of ten iridoid and secoiridoids in the samples 1-5(mg/g) Compounds l 2

墨垒坐趔笪
3 4 5



the value is mean

4-S.D.(n=3).

6n.d.,the amount ofcompound was below the limit ofdetection. 。tr.the amount of compound was below the limit of quantification.

5.3讨论和结论
5.3.1色谱条件的优化

由于所要分离的10种环烯醚萜盼化学结构和极性比较相*,流动相洗 脱时单纯的以等度洗脱很难达到理想的分离效果,所以采用流动相梯度洗

第五章秦艽的质量控制研究

脱。参考iiang等的文献中的洗脱条件,以乙腈和水洗脱,没有得到好的分
离效果;用甲醇替代乙腈,分离效果大为改善,但是峰型和23.28 rain时间 段的分离度不是太好;在流动相中加入一点磷酸,得到了较好的分离效果, 每种化合物都达到了基线分离。 10种分析物都在60 min内出峰,由于分析时间较长,想通过调整梯度 变化的时间缩短分离时间,但是如果梯度变化太大的话,会引起基线漂移, 影响分析的结果。对照品和样品1的色谱图见图5.1。

Fi

g.3

图5-l对照品(A)和样品(B)的色谱图
Fig.5-1 HPLC-UV chromatograms of.(A)a standard mixture of iridoid and secoiridoids; and(B)extract of sample

5.3.2化合物的鉴定

以紫外检测器SPD.20A检测时,样品中各化合物的确定通过和对照品

45

北京化工人学硕上学位论文

保留时间的比较确定;同时在样品中加入单个对照品验证。本实验还通过 质谱仪对各个化合物进行了确定;化合物loganie acid、swertiamarin、6’一D伊D-
glucosyl--gentiopicroside,gentiopicroside,sweroside,6'-O-acetyl gentiopicroside, 6’一O一

(2-hydroxyl一3一G叩一D—glucopyranosyl-benzoyl)-sweroside



2'-O-(2,

3-dihydroxyl.benzoyl)一sweroside、7(R).n-butyl morroniside和7(S)一n?butyl morroniside分别显示一下分子离子峰:399.30([M+Na]+)、375.40([M+H]+)、

541.30(【M+Na]+)、357.30([M+H]+)、359.30([M十HI+)、399.30([M+H】+)、 656.20(【M+H】+)、495.30(【M+H】十)、485.30(【M+Na]十)和485.30([M+Na]十)。
对照品和样品的总粒子流图如图5.2所示;液质连用使用个化合物的保留时
间和碎片离子见表5.5。
Intents 3

lime(ain)
5 Intents

Time(=-in)
图5-2对照品(A)和样品(B)的总粒子流图 HPLC-MS chromatograms of.(A)a standard mixture
of iridoid and

Fig.5-2

secoiridoids;and(B)extract of sample

第五章秦艽的质量控制研究

表5.5化合物的保留时间、碎片离子m/z和鉴定
Table 5-5 The m/z value of each peak of ten iridoid and secoiridoids Peak No.tR(min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 l0 20.00 2 1.12 22.05 25.1 3 27.49。 37.40 40.37 47.76 5 1.4 1 52.44

MS(m/z)
399.30 375.40 54 1.30 357.30 359.30 399.30 656.20 495.30 485.30 485.30

identification logannic acid

swertiamarin 6’.(X良D.glucosylgentiopicroside
gentiopicroside sweroside 6’.O-acetyl gentiopicroside

6’一O-(2-hydroxyl一3?O—p—D—glucopyranosyl—benzoyl)一sweroside
2’.O.(2.3-dihydroxyl.benzoyl)一sweroside 7(R)-n-butyl morroniside 7(S)一,?一butyl morroniside

5.3.3分析方法的验证

从表5.1中可以看出在一定范围内10种环烯醚萜都有很好的线性相关 性,线性相关系数R>0.9991;各检测物的检出限在0.00091xg到0.0042pg这

一范围内,最小定量限在0.0024pg到0.0164lag这一范围内,说明灵敏度较好。
从表5.2可以看出,高中低浓度日内精密度和日间精密度的RSD分别小于3.29%、 1.74%、1.93%和2.89%,说明方法精密度良好;重复性和稳定性试验时,lO种 环烯醚萜的峰面积的RSD均小于4.28%,说明重复性和稳定性良好。各个化合 物的加样回收率在96.6%到102.8之间,证明所建立的方法适用于10种环烯醚萜 化合物的分析。

5.3.4样品分析

所建立的方法用于5种秦艽药材环烯醚萜类化学成分的分析。从表5.4中可 以看出不同的样品个化合物的含量不同;龙胆苦苷是含量最多的化合物,所测药 材其含量在2.40.5.66%之间,符合中国药典的描述。落干酸和6’一0-伊D.
glucosylgentiopicroside在5种药材中的含量也较高,分别在0.33.1.12%和 0.95.2.49%。通过检测还可以看到在样品3中未检测到6’.O.acetyl gentiopicroside, 化合物7(R).n.butyl morroniside在样品3和样品5中未达到定量限。各样品中 lO种环烯醚萜的总含量也不同,其中样品5的环烯醚萜的总含量最高,占药材

重量的9.77%;其与样品中环烯醚萜的量占药材重量的4.27.6.51。
通过检测可以看出样品1、2和4中的龙胆苦苷的含量相差不大;药典中以

龙胆苦胆的含量作为秦艽的质量标准,然而上述药材在临床上质量并不一样,这 说明以龙胆苦苷这一单一成分作为控制秦艽质量的标准并不全面。由于龙胆苦 苷、落干酸、獐芽菜苷和獐芽菜苦苷在秦艽中的含量比较多,许多学者将这四种
47

北京化T大学硕i:学位论文

化合物作为秦艽质量控制标准;但是龙胆属和獐芽菜属植物中广泛的含有此四种 化合物,我们的研究也表明化合物6’.D_伊D.glucosyl.一gentiopicroside在秦艽药 材中的含量较落干酸、獐芽菜苷和獐芽菜苦苷要高,化合物6’。D- (2-hydroxyl.3.0.伊D.glucopyranosyl-benzoyl)一sweroside也有较好的活性,因此以 龙胆苦苷、落干酸、獐芽菜苷和獐芽菜苦苷这四种化合物作为秦艽药材质量控制 的标准也不全面。 由于秦艽药材中10种环烯醚萜化合物含量以及环烯醚萜的总含量不同,为 保证人体用药安全,临床上使用时应该先对药材质量进行评定;本研究所建立的 方法为秦艽质量的鉴定提供了坚实的基础。

5.3.5结论

本研究建立了HPLC.UWMS法测定秦艽中10种环烯醚萜类的有效成分,该
方法精密度高,重现性好,并且快捷、准确、可控,为进一步系统研究和开发秦 艽资源提供了可靠的分析方法;本法也可用于其它药材中环烯醚萜类化合物的分 析检测。

第六章实验部分

第六章实验部分
6.1实验仪器与材料
熔点用Yanaco熔点测定仪(温度未校正);质谱用Waters Quattro
Premier

XE测定;1D-NMR和2D_NMR谱用Bruker-AV600型核磁共振仪测定; HPLC用岛津LC.20A型型高效液相色谱仪;双波长分光光度计为岛津UV.3000 型。 色谱柱为色谱柱为Kromasil—C1 8 column(200×4.6
innl

i.d.;5.0

rtm);柱色谱

用硅胶(200.300目)及薄层色谱用硅胶GF254均为青岛海洋化工厂产品;柱色 谱用聚酰胺(100.140目)以及聚酰胺薄膜为浙江省台州市四清生化材料厂产品;
ODS为YMC Co.LTD产品;Sephadex-LH20为GE 产品。
healthcare Bio—sciences AB

提取分离用试剂为北京化工厂产品,均为分析纯;生物活性测定所用试剂为
Wako公司产品,均为分析纯;色谱纯甲醇、乙腈为天津四友公司产品;细胞色 素C、AA、PMA和fMLP为Sigma公司产品;Polymoyphprep血细胞分离剂 为挪威Nycomed Pharmas产品,其主要成分为13.8%(w/v)泛影酸钠和8%(w/v) 葡萄糖;KBP缓冲液为O.15 M NaCl、6 mM
KCl、1

mM MgCl、1.9 mM
NaCI、2.7

Na2HP04 KCl、1.5

和8.1 mM Nail2P04,PH为7.4;PBS缓冲液为135 mM mM KH2P04和8 mM
K2HP04,pH 7.2。

mM

提取分离用麻花秦艽购自河北安国,经喻长远教授鉴定为Gentiana Maxim。

straminea.

6.2麻花秦艽中化学成分的提取与分离
干燥的麻花秦艽的根(10 kg)切片后,以90%的乙醇回流提取3次,每次2
小时,合并提取液,浓缩后得到的浸膏依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。正 丁醇部分通过反复硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sepdehax-LH 20柱色谱等手段分

离,理化性质和波谱方法鉴定得到22个化合物;化合物的提取分离流程图见
Scheme 3-1。

49

北京化工人学硕Ij学位论文

extracted with 90%EtOH three times Total exl tact(1537

g)
Acand

extracted with CHCl3,Et n—BuOH respectively

CHCl3 Fraction 270 g

EtOAc Fraction 124 g

n—BuOH Fraction 215 g

H20 Fraction
928 g

n.BuOH Fraction Silica gel 60

CHCl3一MeOH(50:1-1:1)

Fr.1 Silk
CHC

Ft.3

Fr.4

Fr.6 icagel 60

Fr.7

Fr.9

gel 60
一EtOAc

C13-MeOH

14 15 16 17 18











第六章实验部分

Fr.3





10

Fr.6

20

1l

23

5l

北京化工人学硕上.学位论文

Fr.9

oDS

MeOH—H20
2 Sephedex LH一20

MeOH—H20

20 Scheme 3-1 The isolation of compounds 1-23 from the roots of Genliana straminea

6.3麻花秦艽中化学成分的鉴定数据
化合物1:白色粉末状结晶(甲醇),mp.179—180℃,分子式为C21H340…
lO%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。 【+]ESI.MS给出准分子离子峰485.6[M+Na]+。1H.NMR和¨C-NMR数据见表3—2, 1H.NMR、13C-NMR、HSQC和HMBC谱见附图。

化合物2:白色粉术状结晶(甲醇),mp.179.180"C,分子式为C21H340Il。 10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。
(+]ESI.MS给出准分子离子峰485.6[M+Na]+。1H.NMR和乃C.NMR数据见表3.2, 1H.NMR、13C.NMR、HSQC和HMBC谱见附图。

化合物3-白色针状结晶(甲醇),mp.208.209。C,比旋光度【0【】D2429.7。 (c--0.25,MeOH),分子式为c18H220lo。10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,
Molish反应呈阳性。(+)ESI.MS给出准分子离子峰421.1[M+Na]+。1H.NMR和

13C-NMR数据见表3.3,1H.NMR、13C.NMR、HSQC和HMBC谱见附图。 化合物4:白色粉末状结晶(甲醇),mp.179.180。C,比旋光度【a]D24.34.5。
(c-0.25,pyridine),分子式为C29H36017。10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,FeCl3

反应呈阳性,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。(+)EsI.MS给出准分子离 子峰679.7[M+Na]+,(-)ESI.MS给出准分子离子峰655.6[M—HI+。1H.NMR和 13C-NMR数据见表34,1H-NMR、13C.NMR、HSQC和HMBC谱见附图。 化合物5:白色粉末状结晶(甲醇),mp.179.180。C,分子式为C16H2009。
52

第六章实验部分

10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。与 龙胆苦苷标准品共薄层共薄层,Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降。 1H.NMR数据见化合物5的鉴定,1H.NMR谱见附图。 化合物6:白色粉末状结晶(甲醇),mp.111.113℃,分子式为C16H220lo。
10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。与

獐芽菜苦苷标准品共薄层共薄层,Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降。 化合物7:白色粉末状结晶(甲醇),mp.113.115。C,分子式为C16H220ll。
10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。与 獐芽菜苷标准品共薄层共薄层,Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降。

化合物8:黄白色粉木状结晶(甲醇),mp.126.128。C,分子式为C16H240lo。 10%H2s04乙醇显色呈粉红色斑点,Molish反应呈阳性酸水解检出葡萄糖。

(.)ESI.MS给出准分子离子峰375.0[M.H]+。1H.NMR和13C.NMR数据见表3.5,
1H.NMR、13C.NMR、HSQC和HMBC谱见附图。

化合物9:黄白色粉末状结晶(甲醇),比旋光度【Q】D26-111.5。(萨1.36,MeOH),
分子式为C22H30014。10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸
水解检出葡萄糖。1H-NMR和13C-NMR数据见表3.5,1H.NMR和13C.NMR谱 见附图。

化合物10:白色粉术状结晶(甲醇),分子式为C29H34017。10%H2S04乙醇显 色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。与对照品 2'-O-(2.3.dihydroxyl.benzoyl).sweroside共薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔
点不下降。

化合物11:白色粉末状结晶(丙酮),mp.132.134。C,分子式C25H34014。 10%H2S04乙醇显色呈紫红色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出葡萄糖。
1H.NMR数据如下:6.53(1H,S,H-3)、7.62(1H,S,H一6)、6.410H,d,J--10.2Hz,H-13、 5.66(1H,d,J=10.2Hz,H一23、1.40(2H,S,H-47,H一5’)、3.79(3H,S,OMe一2)、5.67(1H, d,J=7.8Hz,H?1”)、5.47(1H,d,J=7.8Hz,H—l”,)、4.180n,d,J--7.2Hz,H-6”a)、 4.000H,d,J=7.4Hz,H.6’,b)、3.0—3.77(10H,H.2".H.5”,H.2'"-H.6…),13C-NMR数 据见表3-6,1H-NMR和13C.NMR谱见附图。

化合物12:白色粉术状结晶(甲醇),mp.245—248。C,分子式为C34H460i8。 10%H2S04乙醇显色呈粉红色斑点,Molish反应呈阳性,FeCl3反应呈阳性,酸
水解检出葡萄糖。1H.NMR数据如下:6.66(1H,S,H.2)、6.66(1H,S,H一6)、6.66(1H, d,J=2.8Hz,H-7)、4.67(1H,S,H-2)、3.09(1H,m,H-8)、3.83(1n,d,J=6.6Hz,H-9a)、 4.20(tH,m,H-9b)、6.66(1H,S,H?2’)、6.660M,S,H-63、6.660H,d,J=2.8Hz,H一73、 4.67(1H,s,H-2’)、3.09(1H,m,H-8’)、3.83(1H,d,J=6.6Hz,H一9’a)、4.20(1n,m,

53

北京化丁人学硕士学位论文

H-9"o)、4.91(1H,d,J=7.2Hz,H-1”)、3.18(2H,m,H-6”)、4.91(1H,d,J=7.2Hz,H—l”’)、 3.18(2H,m,H-6”’)、3.72(12H,OMe.3,5,3’,5’),¨C—NMR数据见表3-6,1H.NMR 和13C.NMR谱见附图。

化合物13-无色针状结晶(氯仿),mp.262.263*(2,分子式C15HI004。FeCl3
反应呈阳性。‘H.NMR数据如下:4.68(1H,t,J=12Hz,H.3)、3.53(1H,t,J=12Hz, n-4)、8.00(1H,s,H一5)、5.90(2H,s,H-6)、8.56(1H,d,J=8.4Hz,H一9)、7.92(1H,dd, J=6.6,8.4Hz,H.10)、8.43(1H,d,J=6.6Hz,H.11),13C.NMR数据见表3-6,1H-NMR 和13C.NMR谱见附图。

化合物14:无色粉末状结晶(甲醇),mp.110.112℃,分子式C14H1409。
lO%H2S04乙醇显色呈紫色斑点,Molish反应呈阳性,FeCl3反应呈阳性,酸水 解检出葡萄糖。1H.NMR数据如下:io.26(1H,br,.OH)、7.35(1r1,d,J=7.8Hz,H.4)、 6.85(1I-I,t,J=7.8Hz,H一5)、7.40(1H,t,J=7.8Hz,H一6)、4.84(1H,d,J=7.2Hz,H-1,)、 3.17.3.70(6H,H.2 7一H。6’)、3.87(3I-I,s,OMe-7),13C.NMR数据见表3-6,1H.NMR 和BC.NMR谱见附图。

化合物15-无色针状结晶(氯仿),mp.145—147"C,分子式CioHs03。1H.NMR
数据如下:3.59(2H,t,J=12Hz,H一3)、4.56(2H,t,J=12Hz,H一4)、8.39(1H,d,J=7.8Hz, H-6)、8.05(1H,d,J=7.2Hz,H-7)、7.63(]I-i,t,J=7.8Hz,H-8)、10.22(1H,s,[-1-10), 13C.NMR数据见表3.6,1H.NMR和13C-NMR谱见附图。

化合物16-无色针状结晶(氯仿),mp 178"-"180℃,分子式C30H4802。 10%H2S04乙醇显色呈粉红色斑点,Lieberman.Burchard反应呈阳性。与栎瘿酸 对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降。 化合物17-白色针状结晶(氯仿),mp 180"--"182℃,分子式C30H5002。 lO%H2S04乙醇显色呈褐色斑点,Lieberman.Burchard反应阳性。与乌苏醇对照 品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降。 化合物18:无色颗粒状结晶(甲醇),mp
290"---293

12,分子式C35H6006。

lO%H2S04乙醇显色呈褐色斑点,Lieberman.Burchard和Molish反应均呈阳性, 酸水解检出葡萄糖。与胡萝卜苷对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔
点不下降。

化合物19.-无色粉末状结晶(氯仿),mp 137"---139℃,分子式CzgHsoO。
lO%H2S04乙醇显色呈褐色斑点,Lieberman.Burchard反应呈阳性。1H.NMR和 13C.NMR数据见化合物化合物19的鉴定,1H—NMR和13C.NMR谱见附图。

化合物20:无色颗粒状结晶(甲醇.水),mp 208--J210℃,分子式C18H31016。 10%H21S04乙醇显色呈黑色斑点,Molish反应呈阳性,酸水解检出伊葡萄糖、弘 葡萄糖和a.果糖。 (+)ESI.MS给出准分子离子峰527.O[M+Na]+。化合物与

第六章实验部分

gentianose对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,混合熔点不下降,1H-NMR和
13C-NMR谱见附图。

化合物21:无色颗粒状结晶(甲醇.水),mp 150"--152℃,分子式为C6H1206。
10%H2S04乙醇显色呈黑色斑点,Molish反应呈阳性。(+)ESI.MS给出准分子离 子峰202.9[M+Na]+。化合物与fl-glucose对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致,

混合熔点不下降,1H-NMR和13C.NMR谱见附图。 化合物22:无色颗粒状结晶(甲醇.水),mp 150~152℃,分子式为C6H1206。 10%H2s04乙醇显色呈黑色斑点,Molish反应呈阳性。(+)ESI.MS给出准分子离
子峰202.9[M+Na]+。化合物与a—glucose对照品共薄层Rf值及斑点颜色均一致, 混合熔点不下降,1H.NMR和13C.NMR谱见附图。

55

小结与i’f论

小结与讨论
l本文利用液一液萃取、硅胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、ODS柱色谱、Sepdehax.LH

20柱色谱等分离手段,从麻花秦艽的根中分离得到23个化合物,通过理化性质
和波谱方法鉴定了22个化合物,其中环烯醚萜类化合物10个:7(S).n-butyl morroniside(1)、7(R)一n?butyl morroniside(2)、6'-O-acetyl gentiopicroside(3)、

6'-O-(2一hydroxy-3-雌D—glucopyranosyl—benzoyl)一sweroside(4)、gentiopicroside
(5)、
swertiamarin

(6)、

sweroside

(7)、logannic

acid

(8)、

6’一0母D—glueosylgentiopicroside(9)、2’一O一(2,3一dihydroxyl-benzoyl)一sweroside(10);
三萜类化合物2个:roburic acid(16)和uvaol(17);植物甾醇类化合物2个:
daucosterol(18)和fl-sitosterol(19);糖类化合物3个:gentianose

20)、矽-glucose(21)

和ac.glucose(22);Chromene类化合物1个:macrophyiioside D(11);木质素类 化合物1个:(一)-syringaresinol一4,4'-bis-fl-O-D—glucopyranoside(12);苯甲酸衍生 物类化合物1个:gentiaphyllide—E(14);其他类化合物2个:gentiaphyllide—D(13)
和erythrecentaurin(15)。化合物l、3和4是新化合物;化合物2为首次由龙胆 属植物分离得到的化合物;化合物6、7、8、9、1l、12、13、14、15、16和20 为首次由麻花秦艽中分离得到的化合物。

2对由麻花秦艽中分离得到的5种裂环环烯醚*辛擞肟寡缀涂寡趸饔孟 关的生物活性的研究,并初步探讨了它们的构效关系。实验表明,5个环烯醚萜 化合物均对fMLP诱导的人中性粒细胞自由基的产生显示浓度依赖性抑制作用, 其中化合物9的作用最强。化合物4和5对AA和PMA诱导的人中性粒细胞自 由基的产生显示浓度依赖性抑制作用,其中4的抑制作用强于5;化合物6、7 和9不显示明显的抑制作用。5个环烯醚萜化合物均对红细胞的脂质过氧化无明
显的保护作用。动物实验方面,研究了化合物4和5对二甲苯所致小鼠耳肿胀的 影响,两种化合物对二甲苯所致小鼠耳肿胀均有抑制作用,化合物4的抑制活性

强于化合物5。测试了5个环烯醚萜化合物的溶血作用,发现在明显高于显示抑 制活性的浓度下不发生溶血作用。以上生物活性测试结果与麻花秦艽临床用药和 药理方面相吻合,为进一步对其进行研究开发奠定了一定的理论基础。 3建立了HPLC.UV/MS法对秦艽中环烯醚萜化合物的含量进行了测定;此法为 进一步系统研究和开发秦艽资源提供了可靠的分析方法,可以用于秦艽药材的质 量控制。

57

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致谢

致谢
本文是在陈光老师的悉心指导下完成的,从论文的选题、实验的进行以及论 文的写作,无不凝聚着导师的心血。在陈老师的指导下,本人的专业知识和实验 技能都得到很大的提高。在此谨向导师两年多的关心和栽培表示衷心的感谢。 在论文工作期问,还得到了喻长远教授的指导和帮助;在日本高知大学医学 部学*期间,儿玉裕敬教授和横山正尚教授在学*和生活上给予了热心的指导和 关怀;师长们严谨的科学态度、渊博的学识和谦逊坦诚的品格,使我无论在学业 上还是在做人方面都受益无穷,在此表示诚挚的感谢。 在实验工作中,得到了迟海东、王如意、宋丽娜、李占朝、刘颖、赵一鸣和 任红梅等研究生的热心帮助;*⑺锘逗屠盍槔缺究粕膊斡肓瞬糠止ぷ鳎 在此一并表示感谢。 感谢所有培养、关心和帮助过我的师长、同学和朋友。 在我多年的生活和学*中,我的父母和家人给予了我最无私的支持,在我求

学生涯中,他们毫不保留、始终如一的付出,是我求学路上的精神支柱,任何形 式都不足以表达我的敬意和谢意!

研究成果及发表的学术论文

研究成果及发表的学术论文
发表及已接受的论文


Shih堕鳖i,Peicheng
Qualitative
Gentiana straminea

Zhang,Xiztfi

Feng,Changyuan iridoid

Yu,Guang

Chen.

and quantitative determination of ten

and

secoifidoids in

Maxim.by

LC?UV-ESI—MS.Journal

of

Liquid

Chromatography&Related 2 Guang

Chen,—Shihu—Wei Changyuan

Technologies(SCI).submitted
Yu.Secoiridoids from the roots of Gentiana

straminea.Biochemical Systematics and

Ecology(sci).2009,37:766—77 1



列一作


Guang

Chen,—Shihu—Wei,Jin Huang,Jia
of

Sun.A novel C-glycoflavone from the

leaves of Diospyros kaki.Journal

Asian Nature Products

Research(SCI).

2009,11(6):503.507导师为第一作者


危±虐,喻长远,卢立明,陈光.麻花秦艽非环烯醚萜成分的研究.中草药.
已接收 W西 ChangYuan Yu,Guang



ShiHu

Chen.Iridoids glycosides from the roots of
on

Gentiana

straminea[J].The International Symposium

Advanced

Bio,Nano

and pharmaceutical Science and

Technology,May 2009,Beijing.

作者和导师简介

作者和导师简介
作者简介
危士虎,男,1986年出生,山东人。

2009年12月—今,日本高知大学医学部研究者; 2007年9月—今,北京化工大学化学工程与技术硕士,研究方向为天然产
物化学;

2003年9月-2007年7月,陕西科技大学制药工程本科。
攻读硕士期间,发表科研论文4篇。

导师简介

陈光,男,1974年出生;博士,硕士研究生导师。主要从事天然产物的研 究与开发,邮箱:垒垒旦旦赳垫g鲍垒i!:坠塑曼主:金鱼望:蛆。

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麻花秦艽化学成分、生物活性及环烯醚萜含量测定的研究
作者: 学位授予单位: 危士虎 北京化工大学

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